专题九 生物技术实践
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知识内容
要求
1．微生物的分离和培养
实验与探
究能力
2．培养基对微生物的选择作用
3．利用微生物发酵来生产特定的产物
4．从生物材料中提取某些特定的成分
5．运用发酵加工食品的基本方法
6．植物的组织培养
考场传真
1．（2012·课标全国理综，39）为了探究6－BA和IAA对某菊花品种茎尖外植体再生丛芽的影响，某研究小组在MS培养基中加入6－BA和IAA，配制成四种培养基（见下表），灭菌后分别接种数量相同、生长状态一致、消毒后的茎尖外植体，在适宜条件下培养一段时间后，统计再生丛芽外植体的比率（m），以及再生丛芽外植体上的丛芽平均数（n），结果如下表。
培养基
编号
浓度/（mg·L－1）
m/%
n/个
6－BA
IAA
1
0.5
0
76.7
3.1
2
0.1
77.4
6.1
3
0.2
66.7
5.3
4
0.5
60.0
5.0
回答下列问题：
（1）按照植物的需求量，培养基中无机盐的元素可分为______和______两类。上述培养基中，6－BA属于______类生长调节剂。
（2）在该实验中，自变量是______，因变量是______，自变量的取值范围是________________。
（3）从实验结果可知，诱导丛芽总数最少的培养基是______号培养基。
（4）为了诱导该菊花试管苗生根，培养基中一般不加入______（填“6－BA”或“IAA”）。
2．（2012·山东理综，34）辣椒素作为一种生物碱广泛用于食品保健、医药工业等领域。辣椒素的获得途径如图。
（1）图中①和②分别表示辣椒组织培养中细胞的______和______过程。
（2）图中培养外植体的培养基中常用的凝固剂是______。培养基中的生长素和细胞分裂素用量的比值______（填“高”或“低”）时，有利于芽的分化。对培养基彻底灭菌时，应采取的灭菌方法是______。
（3）图中外植体的消毒所需酒精的体积分数是______。用酶解法将愈伤组织分离成单细胞时，常用的酶是______和纤维素酶。
（4）提取辣椒素过程中，萃取加热时需安装冷凝回流装置，其目的是______。
3．（2012·海南，30）回答下列关于腐乳制作的问题：
（1）腐乳是豆腐经微生物发酵后制成的食品。多种微生物参与了该发酵过程，其中起主要作用的微生物是________，其产生的蛋白酶可将豆腐中的蛋白质水解为________和________；其产生的________能将豆腐中的脂肪水解为________和________。
（2）发酵完成后需加盐腌制，加盐还可以抑制________生长。
（3）腐乳制作的后期可加入由酒和多种香辛料配制而成的卤汤。卤汤除具有一定的防腐作用外，还能使腐乳具有独特的________。
4．（2012·浙江自选模块，17）幽门螺杆菌（Hp）感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。实验基本步骤如下：
请回答：
（1）在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为Hp含有______________，它能以尿素作为氮源；若有Hp，则菌落周围会出现______________色环带。
（2）下列对尿素溶液进行灭菌的最适方法是__________灭菌。
A．高压蒸汽 B．紫外灯照射
C．70%酒精浸泡 D．过滤
（3）步骤X表示______________。在无菌条件下操作时，先将菌液稀释，然后将菌液______________到培养基平面上。菌液稀释的目的是为了获得______菌落。
（4）在培养时，需将培养皿倒置并放在______________中。若不倒置培养，将导致______________。
（5）临床上用14C呼气试验检测人体是否感染Hp，其基本原理是Hp能将14C标记的______________分解为NH3和14CO2。
考向分析
从近几年的高考试题看，本专题内容的考查难度不大。由于生物技术实践强调的是考生的动手能力，因此以笔试的形式考查时只能从实验的原理、方法步骤、注意事项等方面入手，因此试题常会以简述或填图的形式考查对原理的理解和应用，以及在实验过程中解决实际问题的能力。复习时要从实验角度剖析每项技术，把握其原理、材料、操作方法、注意事项等；要用比较的方法区分一些重要概念和相关的方法步骤。复习过程中可以以默写或填写流程图、示意图、看图讲述过程的形式训练图文转换能力。
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热点例析
热点一 微生物的培养和应用
1．微生物的培养、分离与计数
（1）微生物的筛选与鉴定
所选
培养基
原理
用途
举例
选择
培养基
培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长
从众多微生物中分离出特定微生物
尿素为唯一氮源筛选出分解尿素的细菌，纤维素为唯一碳源筛选出纤维素分解菌
鉴别
培养基
根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品
鉴别不同种类的微生物
尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，则培养基中有尿素分解菌
（2）微生物的两种纯化方法比较
平板划线法
稀释涂布平板法
操作
方法
通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线操作将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养
结果
在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的菌落
在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落
（3）微生物的计数方法归纳
①显微镜直接计数法
a．方法：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积样品中微生物的数量。
b．缺点：不能区分死菌和活菌。
②间接计数法（活菌计数法）
a．方法：一般用稀释涂布平板（或平板划线）法，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能测出样品中大约含有多少活菌。
b．计算公式：每克样品中的菌株数＝（C÷V）×M，C表示某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V表示涂布平板时所用稀释液的体积（mL），M表示稀释倍数。
2．微生物在传统发酵技术中的应用
（1）果酒、果醋、腐乳、泡菜制作中所用菌种及控制条件的比较
（2）果酒、果醋、腐乳和泡菜制作过程的比较及亚硝酸盐含量的检测
果酒和果醋制作
腐乳的制作
制作泡菜并检测亚硝酸盐含量
制作原理
果酒：无氧呼吸
果醋：有氧呼吸
多种微生物发酵
泡菜制作：乳酸菌无氧呼吸
亚硝酸盐检测：在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N1萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料
实验流程图
挑选葡萄→冲洗→榨汁
→酒精发酵→醋酸发酵
↓ ↓
果酒 果醋
让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制
操作提示
材料的选择与处理；防止发酵液被污染；控制好发酵条件
控制好材料的用量；防止杂菌污染
泡菜坛的选择；腌制的条件；测定亚硝酸盐含量的操作
【例1】（2012·湖南长、望、浏、宁四市一模）某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验，包括制备培养基、灭菌、接种、培养及菌落观察与计数。请回答与此实验相关的问题。
（1）培养基中含有的蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了________和________。除此之外，培养基还必须含有的基本成分是________和________。
（2）对培养基进行灭菌，应该采用的方法是_______________________________。
（3）为了尽快观察到实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于________中培养，培养的温度设定在37 ℃。要使该实验所得结果可靠，还应同时在另一平板上接种______作为对照实验。
（4）培养20小时后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中有________种细菌。一般说来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越________。
（5）如果提高培养基中NaCl的浓度，可以用来筛选耐________的细菌，这种培养基被称为__________。
解析：培养基的基本成分是碳源、氮源、水、无机盐等。培养基应进行高压蒸汽灭菌。接种后的平板应置于恒温培养箱中培养。培养后可根据菌落的特征来判断细菌的种类，不同特征的菌落越多，说明水样中细菌的种类越多；菌落数越多，说明水样中细菌的数量越多。培养基中加入高浓度的NaCl，可以把耐盐的细菌筛选出来，这种培养基称为选择培养基。
答案：（1）氮源 碳源 无机盐 水 （2）高压蒸汽灭菌 （3）恒温培养箱 无菌水 （4）多 高 （5）盐（或NaCl） 选择培养基
触类旁通（2012·河南洛阳高三统考）苹果醋口味酸甜，且能保健美容，是目前大众非常喜爱的饮品。下图是苹果醋的制作流程简图，请据图回答问题。
＋―→
（1）过程②中使用到的微生物是__________________，该微生物的代谢类型是__________________。该微生物可以从食醋中分离纯化获得，方法是：
第一步：（配制培养基）该培养基必须含有微生物生长所需要的_______________________等基本营养成分。
第二步：对培养基用______________方法进行灭菌。
第三步：（接种）微生物常用的接种方法有_____________________________。
第四步：（培养）温度控制在________________。
第五步：挑选符合要求的菌落。
（2）在苹果醋的制作过程中为防止杂菌污染所用发酵瓶要进行______________________，后期发酵时通气口的阀门要及时______________（填“开”或“关”）。
热点二 DNA和蛋白质技术
1．细胞内DNA复制与体外DNA扩增（PCR技术）的比较（见下表）
细胞内DNA复制
PCR
不同点
解旋
解旋酶，边解旋边复制
80～100 ℃高温解旋，双链完全分开
酶
DNA解旋酶、DNA聚合酶
TaqDNA聚合酶
引物
DNA
单链DNA或RNA
能量
ATP
不加
温度
体内温和条件
高温
循环次数
受生物体自身控制
30多次
相同点
a．提供DNA模板
b．四种脱氧核苷酸作原料
c．子链延伸的方向都是从5′端到3′端
d．都需在一定的缓冲溶液中进行
2．蛋白质的提取和分离（见下表）
步骤
操作
样品处理
通过红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液等操作收集到血红蛋白溶液
粗分离
通过透析法去除血红蛋白溶液中的相对分子质量较小的杂质
纯化
通过凝胶色谱法分离相对分子质量不同的蛋白质
纯度鉴定
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳判断纯化的蛋白质是否达到要求
【例2】根据PCR反应系统模式图回答下列问题。
（1）PCR反应需要在一定的________溶液中进行，除了调控温度外，溶液中还需要提供哪些条件？_________________________________________________________
________________________________________________________________________。
（2）如把一个用15N标记的某个DNA样品，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，经过PCR仪5次循环后，将产生________个DNA分子，其中含14N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例为________。在研究15N标记的一个DNA分子中，发现腺嘌呤占35%，则由15N标记的这个DNA分子的一条链上，鸟嘌呤的最大值可占此链碱基数的________。
（3）分别以不同生物DNA样品为模板合成的各个新DNA之间存在差异，这些差异是什么？__________________________________。PCR扩增得到的DNA序列长度是固定的，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
（4）某个DNA分子的碱基总数中腺嘌呤为200个，利用PCR技术循环数次后，消耗周围环境中腺嘌呤脱氧核苷酸3 000个，该DNA分子已循环了________次。
解析：PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行，除了调控温度外，溶液中还需要提供DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶；5次循环后，将产生25个DNA分子，即32个DNA分子；由于DNA分子是半保留式复制，所以每个DNA分子都含有14N标记的链，故含14N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例为100%；DNA分子中35%是腺嘌呤，则鸟嘌呤的最大值可占此链碱基数为1－35%×2＝30%；DNA的差异性表现在脱氧核苷酸的数目、比例和排列顺序的不同；DNA聚合酶只能从引物的3′端开始延伸，所以特异性地复制处于两个引物之间的DNA片段。设该DNA分子循环了n次，消耗环境中的A为200×（2n－1），即200×（2n－1）＝3 000，得出n＝4。
答案：（1）缓冲 DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶
（2）32 100% 30%
（3）脱氧核苷酸的数目、比例和排列顺序的不同 DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA片段
（4）4
1．（2012·吉林长春期中质检）富集培养是微生物学中的最强有力的技术手段之一。主要是利用不同微生物生命活动特点的不同，制定环境条件，使仅适应该条件的微生物旺盛生长，从而使其数量大大增加。下图描述了采用富集方法从土壤中分离能降解酚类化合物——对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。请分析回答下列问题。
（1）①→③重复培养的目的是___________________________________________。
（2）⑤的菌落中大部分是降解____________微生物。设置⑥的目的是__________。
（3）⑤→⑥采用单细胞挑取法，将所选菌种接种到⑥的培养基中，在操作过程中为防止污染应注意的事项是：接种环要____________________灭菌，待其________后，再挑取菌落接种到试管中，并塞好棉塞，操作完成后需将接种环在火焰上灼烧，目的是__________________。
（4）如果用这种方法分离土壤中的纤维素分解菌，经常用加入了____________的鉴别培养基，在该培养基上，纤维素分解菌会因为产生纤维素酶使菌落周围出现________。
2．（2012·湖北八市3月联考）现代人吃什么都讲究天然，所以目前市场上果汁饮料越来越受到青睐。请根据所学的有关知识回答下列问题。
（1）果汁饮料的包装瓶上写着105 ℃高温瞬时灭菌的意思是在105 ℃下灭菌30秒，这样做的目的是__________________________________。
（2）自己在家中榨的果汁很容易腐败，而果汁装瓶上写着“不含任何防腐剂，最长保质期为一年”，其中的奥秘是____________________________________________。
（3）在果汁加工过程中可添加______________酶来提高出汁率和清澈度。
（4）苹果醋是很受欢迎的饮料之一，其生产过程中利用了________的发酵作用，该过程需控制的温度条件是________。
（5）在传统发酵技术中，果醋的制作往往在果酒制作基础上进行，请用相关反应式表示：____________________________________________________。
3．（2012·河北衡水中学第三次模拟）请分析回答下列有关生物技术实践方面的问题。
（1）微生物培养基一般都含有水和无机盐以及________。
（2）在微生物接种过程中，试管口需要通过酒精灯火焰多次，其目的是__________。
（3）分离分解尿素的微生物的实验流程包括：土壤取样、梯度稀释、样品涂布到______培养基上、挑选________。
（4）在植物组织培养过程中，往往需要使用植物激素启动细胞分裂，人为地控制细胞的__________。
参考答案
命题调研·明晰考向
考场传真
1．解析：（1）根据植物的需求量，培养基中的元素分为大量元素和微量元素，6BA属于细胞分裂素类的植物生长调节剂。（2）实验中的自变量是IAA的浓度，因变量是再生丛芽外植体的比率和再生丛芽外植体上的丛芽平均数。自变量的取值范围在0～0.5 mg/L之间。（3）诱导丛芽的总数量为m与n的乘积，所以1号培养基最少。（4）6BA属于细胞分裂素，有利于芽的分化，抑制根的形成。
答案：（1）大量元素 微量元素 细胞分裂素
（2）IAA浓度 再生丛芽外植体的比率（m）和再生丛芽外植体上的丛芽平均数（n） 0～0.5 mg·L－1
（3）1
（4）6BA
2．解析：（1）将外植体培养成愈伤组织，属于脱分化过程，再生根、芽为再分化过程。（2）固体培养基的凝固剂多为琼脂。利于芽分化的激素比例为生长素低于细胞分裂素，高压蒸汽灭菌可以杀死环境中的一切细胞、芽孢、孢子。（3）体积分数为70%的酒精可以杀死外植体表面的微生物。植物细胞间质为果胶和纤维素，可以用果胶酶和纤维素酶使愈伤组织分散为单个细胞。（4）冷凝可以防止有机溶剂的挥发。
答案：（1）脱分化（或去分化） 再分化
（2）琼脂 低 高压蒸汽灭菌
（3）70% 果胶酶
（4）防止有机溶剂的挥发
3．解析：（1）腐乳制作过程中所利用的微生物主要是毛霉，其产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质水解为多肽和氨基酸，其产生的脂肪酶将脂肪水解为甘油和脂肪酸。
（2）发酵完成后加盐能抑制其他微生物的繁殖和生长。
（3）腐乳制作过程中加入酒和香辛料既有防腐作用，又能使腐乳具有独特的风味。
答案：（1）毛霉 肽 氨基酸 脂肪酶 甘油 脂肪酸
（2）微生物
（3）风味
4．解析：（1）幽门螺杆菌中的脲酶能催化尿素分解产生氨，氨溶于水变成氢氧化铵，导致培养基变成碱性，使酚红指示剂呈现红色，因此在菌落周围出现红色环带。
（2）对尿素溶液进行灭菌应用G6玻璃漏斗过滤的方法灭菌；如果用高压蒸汽灭菌会造成尿素的分解；紫外灯照射不适用于对溶液进行灭菌；用70%酒精浸泡不能达到灭菌的目的，会有一部分芽孢存活。
（3）在培养基上接种微生物，用稀释涂布平板法能将聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而在培养基表面形成单个菌落。
（4）对微生物进行培养应在恒温培养箱中进行，将培养皿倒置既可防止因冷凝水过多造成的单菌落连片（不能获得单菌落），也可避免杂菌孢子落到培养基上。
（5）幽门螺杆菌中的脲酶能将尿素分解形成NH3和CO2,14C标记的尿素被分解后产生的14CO2可被检测到。
答案：（1）脲酶 红
（2）D
（3）接种 涂布 单
（4）恒温培养箱 无法形成单菌落
（5）尿素
体系构建·聚焦热点
知识网络
①配制培养基→灭菌→倒平板→接种→培养 ②稀释涂布平板计数法 ③纤维素为唯一碳源
热点例析
【触类旁通】解析：①表示果酒的制作过程，②表示果醋的发酵过程；②过程中的菌种为醋酸（杆）菌，属异养需氧型生物，发酵时的最适温度为30～35 ℃，发酵后期要及时通入氧气，因此通气口阀门应及时打开。
答案：（1）醋酸菌 异养需氧 水、碳源、氮源、无机盐 高压蒸汽 平板划线法、稀释涂布平板法 30～35 ℃ （2）清洗并消毒 开
创新模拟·预测演练
1．解析：①→③的重复培养可使分解对羟基苯甲酸的微生物的比例增高；将经过重复培养的微生物再涂布到含对羟基苯甲酸的培养基上，在平板上能够生长的微生物大部分都能降解对羟基苯甲酸，实验过程中⑥为对照组。接种过程需无菌操作。第一，接种环用前要灼烧，杀死接种环上的微生物，避免污染培养物，第二，整个操作过程需在酒精灯火焰附近完成，第三，操作完成后需将接种环在火焰上灼烧以杀死接种环上的残留微生物，以防止污染。刚果红与纤维素能生成红色复合物，当纤维素分解菌把纤维素分解掉时，红色消失，菌落周围出现透明圈。
答案：（1）扩大培养（或使分解对羟基苯甲酸的微生物的比例增高）
（2）对羟基苯甲酸 对照作用
（3）在火焰上灼烧 冷却 杀灭残留物
（4）刚果红 透明圈
2．解析：高温瞬时灭菌，既保证了杀死引起果汁变质的病原微生物，又不破坏果汁的品质。由于高温杀死了果汁瓶内的微生物，因此在不加防腐剂的条件下也可较长时间的保存。植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，因此使用纤维素酶和果胶酶可使细胞壁中的不溶于水的成分分解成可溶性的糖及半乳糖醛酸，从而提高出汁率并使浑浊的果汁变得澄清。苹果含有大量的糖，在醋酸菌的作用下可转变成醋酸，醋酸菌的最适生长温度为30～35 ℃。
答案：（1）既保证杀死引起果汁变坏的病原体，又不破坏果汁的品质 （2）高温杀死了微生物 （3）纤维素酶和果胶 （4）醋酸菌 30～35℃ （5）C2H5OH＋O2CH3COOH＋H2O
3．解析：微生物的培养基中一般都必须含有碳源、氮源、水、无机盐。试管口通过火焰以达到消灭试管口杂菌的目的。用尿素为唯一氮源的选择培养基来分离分解尿素的微生物。在植物组织培养过程中可人为控制细胞的脱分化和再分化。
答案：（1）碳源和氮源 （2）灭菌 （3）选择 菌落 （4）脱分化、再分化
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