专题九 生物技术实践
考纲点击
知识内容
要求
1．微生物的分离和培养
实验与探
究能力
2．某种微生物数量的测定
3．培养基对微生物的选择作用
4．利用微生物发酵来生产特定的产物以及微生物在其他方面的应用
5．酶活力测定的一般原理和方法
6．酶在食品制造和洗涤等方面的应用
7．植物的组织培养
8．蛋白质的提取和分离
9．PCR技术的基本操作和应用
考场传真
1．（2012·课标全国理综，39）为了探究6－BA和IAA对某菊花品种茎尖外植体再生丛芽的影响，某研究小组在MS培养基中加入6－BA和IAA，配制成四种培养基（见下表），灭菌后分别接种数量相同、生长状态一致、消毒后的茎尖外植体，在适宜条件下培养一段时间后，统计再生丛芽外植体的比率（m），以及再生丛芽外植体上的丛芽平均数（n），结果如下表。
培养基编号
浓度/（mg·L－1）
m/%
n/个
6－BA
IAA
1
0.5
0
76.7
3.1
2
0.1
77.4
6.1
3
0.2
66.7
5.3
4
0.5
60.0
5.0
回答下列问题。
（1）按照植物的需求量，培养基中无机盐的元素可分为______和______两类。上述培养基中，6－BA属于______类生长调节剂。
（2）在该实验中，自变量是______，因变量是______，自变量的取值范围是________________。
（3）从实验结果可知，诱导丛芽总数最少的培养基是______号培养基。
（4）为了诱导该菊花试管苗生根，培养基中一般不加入______（填“6－BA”或“IAA”）。
2．（2012·山东理综，34）辣椒素作为一种生物碱广泛用于食品保健、医药工业等领域。辣椒素的获得途径如图。
（1）图中①和②分别表示辣椒组织培养中细胞的______和______过程。
（2）图中培养外植体的培养基中常用的凝固剂是______。培养基中的生长素和细胞分裂素用量的比值______（填“高”或“低”）时，有利于芽的分化。对培养基彻底灭菌时，应采取的灭菌方法是______。
（3）图中外植体的消毒所需酒精的体积分数是______。用酶解法将愈伤组织分离成单细胞时，常用的酶是______和纤维素酶。
（4）提取辣椒素过程中，萃取加热时需安装冷凝回流装置，其目的是_____________。
3．（2012·海南，30）回答下列关于腐乳制作的问题。
（1）腐乳是豆腐经微生物发酵后制成的食品。多种微生物参与了该发酵过程，其中起主要作用的微生物是________，其产生的蛋白酶可将豆腐中的蛋白质水解为________和________；其产生的________能将豆腐中的脂肪水解为________和________。
（2）发酵完成后需加盐腌制，加盐还可以抑制________生长。
（3）腐乳制作的后期可加入由酒和多种香辛料配制而成的卤汤。卤汤除具有一定的防腐作用外，还能使腐乳具有独特的________。
4．（2012·浙江自选模块，17）幽门螺杆菌（Hp）感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。实验基本步骤如下：
请回答下列问题。
（1）在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为Hp含有____________，它能以尿素作为氮源；若有Hp，则菌落周围会出现____________色环带。
（2）下列对尿素溶液进行灭菌的最适方法是________灭菌。
A．高压蒸汽 B．紫外灯照射
C．70%酒精浸泡 D．过滤
（3）步骤X表示____________。在无菌条件下操作时，先将菌液稀释，然后将菌液____________到培养基平面上。菌液稀释的目的是为了获得____菌落。
（4）在培养时，需将培养皿倒置并放在____________中。若不倒置培养，将导致____________。
（5）临床上用14C呼气试验检测人体是否感染Hp，其基本原理是Hp能将14C标记的____________分解为NH3和14CO2。
考向分析
从近几年的高考试题看，本专题内容的考查难度不大。由于生物技术实践强调的是考生的动手能力，因此以笔试的形式考查时只能从实验的原理、方法步骤、注意事项等方面入手，因此试题常会以简述或填图的形式考查对原理的理解和应用，以及在实验过程中解决实际问题的能力。复习时要从实验角度剖析每项技术，把握其原理、材料、操作方法、注意事项等；要用比较的方法区分一些重要概念和相关的方法步骤。复习过程中可以以默写或填写流程图、示意图、看图讲述过程的形式训练图文转换能力。
知识网络
热点例析
热点一 微生物的培养和应用
1．微生物的培养、分离与计数
（1）微生物的筛选与鉴定
所选
培养基
原理
用途
举例
选择
培养基
培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长
从众多微生物中分离出特定微生物
尿素为唯一氮源筛选出分解尿素的细菌，纤维素为唯一碳源筛选出纤维素分解菌
鉴别
培养基
根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品
鉴别不同种类的微生物
尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，则培养基中有尿素分解菌
（2）微生物的两种纯化方法比较
平板划线法
稀释涂布平板法
操作
方法
通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线操作将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养
结果
在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的菌落
在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落
（3）微生物的计数方法归纳
①显微镜直接计数法
a．方法：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积样品中微生物的数量。
b．缺点：不能区分死菌和活菌。
②间接计数法（活菌计数法）
a．方法：一般用稀释涂布平板（或平板划线）法，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能测出样品中大约含有多少活菌。
b．计算公式：每克样品中的菌株数＝（C÷V）×M，C表示某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V表示涂布平板时所用稀释液的体积（mL），M表示稀释倍数。
2．微生物在传统发酵技术中的应用
（1）果酒、果醋、腐乳、泡菜制作中所用菌种及控制条件的比较
（2）果酒、果醋、腐乳和泡菜制作过程的比较及亚硝酸盐含量的检测
果酒和果醋制作
腐乳的制作
制作泡菜并检测亚硝酸盐含量
制作原理
果酒：无氧呼吸
果醋：有氧呼吸
多种微生物发酵
泡菜制作：乳酸菌无氧呼吸亚硝酸盐检测：在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N－1－萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料
实验流程图
让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制
操作提示
材料的选择与处理；防止发酵液被污染；控制好发酵条件
控制好材料的用量；防止杂菌污染
泡菜坛的选择；腌制的条件；测定亚硝酸盐含量的操作
【例题】（2012·湖南长、望、浏、宁四市一模）某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验，包括制备培养基、灭菌、接种、培养及菌落观察与计数。请回答与此实验相关的问题。
（1）培养基中含有的蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了________和________。除此之外，培养基还必须含有的基本成分是________和________。
（2）对培养基进行灭菌，应该采用的方法是__________________________________。
（3）为了尽快观察到实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于________中培养，培养的温度设定在37 ℃。要使该实验所得结果可靠，还应同时在另一平板上接种______作为对照实验。
（4）培养20小时后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中有________种细菌。一般说来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越________。
（5）如果提高培养基中NaCl的浓度，可以用来筛选耐________的细菌，这种培养基被称为__________。
解析：培养基的基本成分是碳源、氮源、水、无机盐等。培养基应进行高压蒸汽灭菌。接种后的平板应置于恒温培养箱中培养。培养后可根据菌落的特征来判断细菌的种类，不同特征的菌落越多，说明水样中细菌的种类越多；菌落数越多，说明水样中细菌的数量越多。培养基中加入高浓度的NaCl，可以把耐盐的细菌筛选出来，这种培养基称为选择培养基。
答案：（1）氮源 碳源 无机盐 水 （2）高压蒸汽灭菌 （3）恒温培养箱 无菌水 （4）多 高 （5）盐（或NaCl） 选择培养基
触类旁通（2012·广东珠海综合测试二）（双选）下列有关生物技术的叙述，正确的是（ ）
A．果酒、果醋和腐乳的制作所需的适宜温度分别是15～18 ℃，30～35 ℃，18～25 ℃
B．固定化酵母细胞的制备中，关键步骤是向冷却至室温的海藻酸钠溶液中加入已活化的酵母菌细胞
C．DNA粗提取过程中，调节NaCl溶液浓度或者加入木瓜蛋白酶，都可以去除部分杂质
D．果酒、果醋和腐乳制作中使用的菌种都具有细胞壁、核糖体、DNA和RNA
热点二 生物技术在其他方面的应用
植物组织培养技术分析
菊花茎的组织培养
月季的花药培养
理论依据
细胞的全能性
基本过程
脱分化、再分化
影响因素
材料、营养、激素、pH、温度、光照等
选择材料
体细胞
花药（生殖细胞）
操作流程
制备培养基→外植体消毒→接种→培养→移栽→栽培
选材→材料消毒→接种和培养→筛选和诱导→移栽→栽培选育
培养条件
pH为5.8左右；温度18～22 ℃；每日用日光灯照射12 h
温度25 ℃左右，接种一段时间内不需要光照，幼小植株形成后才需光照
1．（2012·广州综合测试二）下列有关物质的提取和分离的说法，错误的是（ ）
A．提取洋葱DNA时，需用洗涤剂瓦解细胞膜
B．直接用差速离心法可分离动物细胞内的各种物质
C．可用电泳法将蛋白质、DNA、RNA等生物大分子分离
D．提取和分离叶绿体色素所用的试剂有无水乙醇、SiO2、CaCO3、层析液
2．（2012·广东韶关二模）（双选）下列有关生物学实验操作、材料、条件等方面的叙述，正确的是（ ）
A．“探究酵母菌种群数量动态变化”实验中，用培养液培养酵母菌
B．“观察细胞有丝分裂”实验中，用卡诺氏液对根尖进行解离
C．“腐乳的制作”实验中，加盐和加酒都能抑制微生物的生长
D．“分解尿素的细菌的分离”实验中，用尿素为唯一营养的培养基筛选目的菌
3．（2012·广东珠海综合测试二）某生物兴趣小组为了“探究培养液中酵母菌种群数量的变化”，按甲图装置进行了实验，并绘制了乙图为不同培养阶段酵母菌种群数量、葡萄糖浓度和乙醇浓度的变化曲线，请回答下列问题。
甲 乙
（1）酵母菌与颤藻共有的细胞结构有__________、细胞膜、细胞质基质和__________。
（2）甲图装置中排气口的胶管设计成长而弯曲的目的是
________________________________________________________________________。
（3）实验的最初阶段，由于__________________________和没有敌害、没有竞争，酵母菌的种群数量呈__________曲线增长。
（4）从乙图知，__________h后出现无氧呼吸，此过程产生的少量ATP的发生场所是__________。
（5）某同学在乙图中的T3时取样，统计的酵母菌种群数量明显高于D点对应的数量，原因可能有____________________________、____________________________和用血细胞计数板计数时出现错误等。
4．（2012·广州综合测试二）请回答与酵母菌有关的问题。
（1）在基因工程中酵母菌常作为____________。酵母菌与T2噬菌体都具有的可遗传变异类型是________________________。
（2）从含有酵母菌、醋酸菌、蓝藻的培养液中分离出酵母菌，最简单的培养方法是：在______条件下进行培养。
（3）在利用酵母菌进行酿酒时，严格密封的情况下发现酒中酸味过重，最可能的原因是________________________________________________________________________
____________________。
（4）下图是探究酵母菌细胞呼吸方式的实验装置，在实验过程中酵母菌始终保持活性（忽略实验室的温度和大气压强对实验结果的影响）。
①请填写下表：
红色液滴移动情况
结论
Ⅰ．向________移动
进行有氧呼吸，同时可能进行无氧呼吸
Ⅱ．不移动
____________________
②如果要确定酵母菌只进行有氧呼吸，应如何完善实验设计？______________________。
并预测实验现象：__________________。
5．（2012·湖南衡阳第一次联考）（1）“闻着臭，吃着香”的臭豆腐驰名中外，其制作过程中所用的微生物主要是____________，臭豆腐表面往往有一层致密的“皮”，这层“皮”实际上是微生物的____________，它对人体是无害的。
（2）欲从土壤中分离出能高效分解石油烃的细菌，可在含____________丰富的土壤环境中取样；若想对初步筛选得到的目的菌进行纯化并计数，可采用的接种方法是____________。
6．（2012·河北衡水中学第三次模拟）请分析回答下列有关生物技术实践方面的问题。
（1）微生物培养基一般都含有水和无机盐以及________。
（2）在微生物接种过程中，试管口需要通过酒精灯火焰多次，其目的是__________。
（3）分离分解尿素的微生物的实验流程包括：土壤取样、梯度稀释、样品涂布到______培养基上、挑选________。
（4）在植物组织培养过程中，往往需要使用植物激素启动细胞分裂，人为地控制细胞的__________。
参考答案
命题调研·明晰考向
考场传真
1．解析：（1）根据植物的需求量，培养基中的元素分为大量元素和微量元素，6－BA属于细胞分裂素类的植物生长调节剂。（2）实验中的自变量是IAA的浓度，因变量是再生丛芽外植体的比率和再生丛芽外植体上的丛芽平均数。自变量的取值范围在0～0.5 mg/L之间。（3）诱导丛芽的总数量为m与n的乘积，所以1号培养基最少。（4）6－BA属于细胞分裂素，有利于芽的分化，抑制根的形成。
答案：（1）大量元素 微量元素 细胞分裂素
（2）IAA浓度 再生丛芽外植体的比率（m）和再生丛芽外植体上的丛芽平均数（n） 0～0.5 mg·L－1
（3）1
（4）6－BA
2．解析：（1）将外植体培养成愈伤组织，属于脱分化过程，再生根、芽为再分化过程。（2）固体培养基的凝固剂多为琼脂。利于芽分化的激素比例为生长素低于细胞分裂素，高压蒸汽灭菌可以杀死环境中的一切细胞、芽孢、孢子。（3）体积分数为70%的酒精可以杀死外植体表面的微生物。植物细胞间质为果胶和纤维素，可以用果胶酶和纤维素酶使愈伤组织分散为单个细胞。（4）冷凝可以防止有机溶剂的挥发。
答案：（1）脱分化（或去分化） 再分化
（2）琼脂 低 高压蒸汽灭菌
（3）70% 果胶酶
（4）防止有机溶剂的挥发
3．解析：腐乳制作过程中所利用的微生物主要是毛霉，其产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质水解为多肽和氨基酸，其产生的脂肪酶将脂肪水解为甘油和脂肪酸。
（2）发酵完成后加盐能抑制其他微生物的繁殖和生长。
（3）腐乳制作过程中加入酒和香辛料既有防腐作用，又能使腐乳具有独特的风味。
答案：（1）毛霉 肽 氨基酸 脂肪酶 甘油 脂肪酸
（2）微生物
（3）风味
4．解析：（1）幽门螺杆菌中的脲酶能催化尿素分解产生氨，氨溶于水变成氢氧化铵，导致培养基变成碱性，使酚红指示剂呈现红色，因此在菌落周围出现红色环带。
（2）对尿素溶液进行灭菌应用G6玻璃漏斗过滤的方法灭菌；如果用高压蒸汽灭菌会造成尿素的分解；紫外灯照射不适用于对溶液进行灭菌；用70%酒精浸泡不能达到灭菌的目的，会有一部分芽孢存活。
（3）在培养基上接种微生物，用稀释涂布平板法能将聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而在培养基表面形成单个菌落。
（4）对微生物进行培养应在恒温培养箱中进行，将培养皿倒置既可防止因冷凝水过多造成的单菌落连片（不能获得单菌落），也可避免杂菌孢子落到培养基上。
（5）幽门螺杆菌中的脲酶能将尿素分解成NH3和CO2,14C标记的尿素被分解后产生的14CO2可被检测到。
答案：（1）脲酶 红
（2）D
（3）接种 涂布 单
（4）恒温培养箱 无法形成单菌落
（5）尿素
体系构建·聚焦热点
知识网络
①配制培养基→灭菌→倒平板→接种→培养 ②稀释涂布平板计数法 ③纤维素为唯一碳源 ④植物细胞全能性 ⑤脱分化、再分化
热点例析
【触类旁通】CD 解析：果酒、果醋和腐乳的制作所需的适宜温度分别是18～25 ℃，30～35 ℃，15～18 ℃，A项错误；固定化酵母细胞的制备中，关键步骤是海藻酸钠溶液的配制，B项错误；DNA粗提取过程中，调节NaCl溶液浓度或者加入木瓜蛋白酶，都可以去除部分杂质，C项正确；果酒、果醋和腐乳制作中使用的菌种都具有细胞壁、核糖体、DNA和RNA，D项正确。
创新模拟·预测演练
1．B 解析：提取洋葱DNA时，需用洗涤剂瓦解细胞膜，A项正确；应该先用蒸馏水处理动物细胞，使其吸水涨破，然后用差速离心法就可将细胞内的各种物质分离，B项错误；因为蛋白质、DNA、RNA等生物大分子在溶液中都可解离成带电粒子，所以可用电泳法将其分离，C项正确；提取叶绿体色素所用的试剂有无水乙醇、SiO2、CaCO3，分离色素需要用层析液，D项正确。
2．AC 解析：“探究酵母菌种群数量动态变化”实验中，需要用培养液培养酵母菌，A项正确；“观察细胞有丝分裂”实验中，用解离液对根尖进行解离，卡诺氏液是一种细胞固定液，可以用于细胞形态的固定，B项错误；“腐乳的制作”实验中，高浓度的盐和酒精都会杀死微生物，所以加盐和加酒都能抑制微生物的生长，C项正确；“分解尿素的细菌的分离”实验中，用尿素为唯一碳源的培养基筛选目的菌，除了碳源外，微生物的生长还需要其他营养，例如水、无机盐等，D项错误。
3．解析：（1）酵母菌与颤藻共有的细胞结构有细胞壁、细胞膜、细胞质基质和核糖体。
（2）甲图装置中排气口的胶管设计成长而弯曲的目的是防止空气中的杂菌污染。
（3）实验的最初阶段，由于温度等条件适宜、营养物质充足和没有敌害、没有竞争，酵母菌的种群数量呈“J”形曲线增长。
（4）从乙图知，T1后开始产生乙醇，即出现无氧呼吸，此过程产生的少量ATP的发生场所是细胞质基质。
（5）某同学在乙图中的T3时取样，统计的酵母菌种群数量明显高于D点对应的数量，原因可能有取样时培养液未摇匀，从底部取样；未染色，统计的菌体数包含了死亡的菌体和用血细胞计数板计数时出现错误等。
答案：（1）细胞壁 核糖体
（2）防止空气中的杂菌污染
（3）温度等条件适宜、营养物质充足 “J”形
（4）T1 细胞质基质
（5）取样时培养液未摇匀，从底部取样 未染色，统计的菌体数包含了死亡的菌体
4．解析：（1）在基因工程中酵母菌常作为受体细胞；T2噬菌体是病毒，不能进行染色体变异和基因重组，只有基因突变，所以它们共有的可遗传变异类型是基因突变。
（2）根据三类生物的代谢特点进行分离，酵母菌属于异养兼性厌氧性微生物，醋酸菌属于异养需氧型微生物，蓝藻属于自养需氧型生物，分离出酵母菌，最简单的培养方法是在无光、无氧条件下进行培养。
（3）在利用酵母菌进行酿酒时，严格密封的情况下发现酒中酸味过重，最可能的原因是培养液或菌种混有能产生酸性物质的微生物（杂菌），如乳酸菌等。
（4）①酵母菌细胞呼吸会消耗装置中的氧气，产生二氧化碳，从而改变瓶内气压，导致液滴移动，但由于装置中放置的NaOH溶液会吸收细胞呼吸产生的二氧化碳，所以二氧化碳不会对瓶内气压产生影响，实验过程中能改变瓶内气压的只有氧气。只要进行有氧呼吸，消耗瓶内氧气，液滴就会左移，液滴不移动，说明没有消耗氧气，则只进行了无氧呼吸。②如果要确定酵母菌只进行有氧呼吸，应将装置中的NaOH溶液换成等量的蒸馏水，其他条件相同。由于有氧呼吸过程中，细胞消耗的氧气与产生的二氧化碳体积相等，所以，如果只进行有氧呼吸，瓶内气压没有变化，液滴不移动。
答案：（1）受体细胞 基因突变
（2）无光、无氧
（3）培养液或菌种混有能产生酸性物质的微生物
（4）①Ⅰ．左 Ⅱ．只进行无氧呼吸
②将装置中的氢氧化钠溶液换成等量的蒸馏水，其他条件相同 液滴不移动
5．解析：腐乳制作过程中，毛霉起了主要作用，毛霉菌丝呈棉絮状。从土壤中分离出分解石油烃的细菌，应在含石油烃丰富的土壤中取样，纯化并计数可选用稀释涂布平板法。
答案：（1）毛霉 匍匐菌丝
（2）石油烃 稀释涂布平板法
6．解析：微生物的培养基中一般都必须含有碳源、氮源、水、无机盐。试管口通过火焰以达到消灭试管口杂菌的目的。用尿素为唯一氮源的选择培养基来分离分解尿素的微生物。在植物组织培养过程中可人为控制细胞的脱分化和再分化。
答案：（1）碳源和氮源 （2）灭菌 （3）选择 菌落 （4）脱分化、再分化
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