选修三　现代生物科技专题 第1讲　基因工程——及其安全性(含生物武器) S (1)基因工程的诞生(Ⅰ)　(2)基因工程的原理及技术(Ⅱ)　(3)基因工程的应用(Ⅱ)　(4)蛋白质工程(Ⅰ)　(5)转基因生物的安全性(Ⅰ)　(6)生物武器对人类的威胁(Ⅰ)
一、基因工程的概念及基本工具 1．概念 (1)操作环境：体外 (2)操作水平：分子(DNA)水平，又叫①________ (3)原理：②________ (4)优点：定向改造生物性状 2．基因工程的基本工具 (1)限制 性核 酸内 切酶 (2)DNA连接酶 常用类型 E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶  来源 ⑦________ T4噬菌体  功能 连接黏性末端 连接⑧________  结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键  (3)载体 ①常用载体 ——质粒 ②其他载体：λ噬菌体衍生物、?________等。 二、基因工程的基本操作程序 1．目的基因的获取 (1)目的基因：编码蛋白质的基因。 (2)获取方法：从基因文库中获取、利用?________扩增目的基因、利用?________人工合成。 2．基因表达载体的构建——基因工程的核心 (1)目的：使目的基因在受体细胞中?____________，并可以遗传给下一代；使目的基因能够?____________和发挥作用。 (2)基因表达载体的组成：目的基因、?________、终止子和标记基因等，如图。

①与载体相比较，增加启动子、目的基因和终止子三个基因片段，其功能各不相同。 ②启动子(DNA片段)≠起始密码子(RNA)；终止子(DNA片段)≠终止密码子(RNA)。 3．将目的基因导入受体细胞 导入植物细胞：?________________、基因枪法、花粉管通道法 导入动物细胞：?____________ 导入微生物的方法：先用?________处理再融合 4．目的基因的检测和鉴定 (1)检测：分子水平。 检测是否有目的基因：分子杂交技术 (?________＋转基因生物________) 检测是否转录：分子杂交技术 (DNA探针＋转基因生物________) 检测是否翻译：________ (2)鉴定：个体水平。 三、基因工程的应用 技术名称 应用  植物基因 工程 培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和________转基因植物，利用转基因改良植物的品质  动物基因 工程 提高动物生长速度，改善畜产品的品质，用转基因动物生产药物，用转基因动物作________的供体  基因治疗 把________导入病人体内，使其表达产物发挥作用，从而治疗疾病，分为体内基因治疗和体外基因治疗  四、蛋白质工程 1．崛起缘由 天然蛋白质________人类生产和生活的需要。 2．目标 根据人们对蛋白质功能的特定需求，对________进行分子设计。 3．操作手段 基因修饰或基因合成。 4．设计流程 预期蛋白质功能―→设计预期蛋白质结构―→推测应有的________序列―→找到对应的________序列(基因)。
自我校对： ①DNA重组技术　②基因重组　③原核生物　④磷酸二酯键　⑤特定的脱氧核苷酸序列　⑥黏性末端　⑦大肠杆菌　⑧黏性末端或平末端　⑨限制酶　遗传标记基因　?动植物病毒　?PCR技术　　?DNA合成仪　?稳定存在　?表达　?启动子　?农杆菌转化法　?显微注射法　?Ca2＋　?DNA探针　DNA　mRNA　抗原—抗体杂交　抗逆　器官移植　正常基因　不一定完全符合　蛋白质的结构　氨基酸　脱氧核苷酸

基因工程的理论基础与操作工具   1．基因工程的基本原理和理论基础概括(如下图)
2．与DNA分子相关的酶 (1)几种酶的比较 比较项目 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 解旋酶  作用底物 DNA分子 DNA分子片段 脱氧核苷酸 DNA分子  作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 碱基对间的氢键  作用结果 形成黏性末端或平末端 形成重组DNA分子 形成新的DNA分子 形成单链DNA分子  (2)限制酶与DNA连接酶的关系
①限制酶不切割自身DNA的原因是：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 ②DNA连接酶起作用时不需要模板。 3．载体 (1)作用 ①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。 ②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。 (2)具备的条件 ①能在宿主细胞内稳定保存并大量复制。 ②有多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。 ③具有特殊的标记基因，以便进行筛选。 (3)种类 ①质粒：一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，能够自我复制的很小的双链环状DNA分子。 ②λ噬菌体的衍生物。 ③动植物病毒。
(1)一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造。(2)限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。
★　本部分知识多以选择题的形式出现，并且与必修内容联系密切，也可在基因工程综合题中作为某一具体问题出现。 【典例1】 (2012·江苏单科，32)图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ 4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为CCGG、GGATCC、GATC、CCCGGG。请回答下列问题。

(1)图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由________连接。 (2)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是________________________末端，其产物长度为______________。 (3)若图1中虚线方框内的碱基对被TA碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有________种不同长度的DNA片段。 (4)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是________。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加________的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 解析　本题主要考查基因工程中限制酶的作用原理和重组质粒构建的相关知识。(1)通过分析DNA分子结构的特点可知，在DNA的一条链中，相邻两个碱基依次由脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖连接。(2)限制酶SmaⅠ的识别序列和酶切位点为CCC↓GGG，酶切位点位于识别序列的中轴线上，所以酶切后形成的末端是平末端。在图1DNA片段中，有两个SmaⅠ的识别序列，完全切割后形成的产物长度有三种，分别为：534＋3＝537bp；796－3－3＝790bp；658＋3＝661bp。(3)D基因突变为d基因后，其碱基序列中只含有一个SmaⅠ的识别序列，此时用SmaⅠ完全切割该DNA片段后产物的长度有两种，分别为：534＋796－3＝1 327bp；658＋3＝661bp。所以，从杂合子(Dd)中分离出的D、d基因DNA片段被SmaⅠ完全切割，产物中有537bp、790bp、661bp、1 327bp 4种不同长度的DNA片段。(4)分析图1 DNA片段上的限制酶酶切位点可知，为了防止目的基因被破坏，并将目的基因从DNA片段中切下来，只能选择用BamHⅠ对目的基因进行处理。质粒用BamH Ⅰ处理后，会破坏抗生素A抗性基因，但抗生素B抗性基因正常，所以筛选含重组质粒的大肠杆菌时，一般需用添加抗生素B的培养基进行培养。因为用同种限制酶处理后目的基因和质粒上形成的黏性末端完全相同，所以部分目的基因D可能会反向连接在质粒上，此类重组质粒上的目的基因D将不能正确表达。 答案　(1)脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖 (2)平　537bp、790bp、661bp (3)4 (4)BamHⅠ　抗生素B 同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接
基因工程的基本操作程序及其应用  高考地位：5年21考 2012福建、全国新课标、江苏、天津，2011江苏、山东、四川、海南，2010天津、四川…… 1．目的基因的获取途径 (1)从基因文库中获取：包括基因组文库和cDNA文库等。 (2)人工合成目的基因的常用方法 ①化学合成法：已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。 ②反转录法：以RNA为模板，在逆转录酶作用下人工合成。 (3)通过PCR技术扩增目的基因 即通过指数式扩增获取大量的目的基因。 2．基因表达载体的构建

①该过程把三种工具(两种工具酶、一种载体)全用上了，是最核心、最关键的一步，在体外进行。 ②基因表达载体结构模式图参见“双基自主落实” 3．将目的基因导入受体细胞 (1)目的：目的基因进入受体细胞内并在受体细胞内维持稳定和表达。 (2)受体细胞种类不同，导入方法不同 生物种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞  常用方法 农杆菌转化法 显微注射技术 Ca2＋处理法  受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞转化  过程 将目的基因插入Ti质粒的T—DNA上―→农杆菌―→导入植物细胞―→整合到受体细胞的DNA上―→表达 将含有目的基因的表达载体提纯―→取卵(受精卵)―→显微注射―→受精卵发育―→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞―→感受态细胞―→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合―→感受态细胞吸收DNA分子  4.目的基因的检测与鉴定

★★★　本部分知识是现代生物科技的核心内容，是高考的重点，各省对本部分内容考查要求不同，高考命题的题型及赋分值有较大差异，但全国新课标卷及各省市卷多有涉及。 【典例2】 (经典题)如图为获得抗虫棉的技术流程。在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因(kanr)常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。
请据图回答问题。 (1)A过程所用的载体是________，需要的工具酶有________和________。 (2)C过程的培养基除含有必需的营养物质、琼脂和激素外，还需加入________。 (3)由图中离体棉花叶片组织获得转基因抗虫植株可采用________技术，该技术所依据的原理是________________________________________________________________________。 (4)如果利用DNA分子杂交原理对再生植株进行检测，D过程应该用放射性同位素(或荧光分子)标记的________作为探针。 (5)如果从个体生物水平来鉴定，D过程可用的最简单检测方法是________________________________________________________________________。 解析　(1)图中作为载体的是含kanr质粒，基因工程中的工具酶有DNA连接酶和限制性核酸内切酶。(2)C过程的培养基为选择培养基，为了筛选出含有目的基因的重组质粒，培养基中应含有卡那霉素。(3)离体植物组织培育植株采用植物组织培养技术，依据的原理是植物细胞的全能性。(4)再生植株检测应该检验是否抗虫，因此要用放射性同位素标记抗虫基因。(5)可以用棉铃虫食用再生植株，通过虫子是否死亡判断是否为抗虫植株。 答案　(1)含kanr质粒　限制性核酸内切酶　DNA连接酶(两种酶顺序可颠倒)　(2)卡那霉素　(3)植物组织培养　植物细胞全能性　(4)抗虫基因　(5)让棉铃虫食用再生植株(抗虫接种实验)
①基因文库中不是直接保管相应基因，基因文库中的基因保存在受体菌中。 ②植物细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程成为完整植物体，因此受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞；动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。 ③目的基因的检测和表达既要在分子水平上进行，还要在个体水平上进行。
关注热点——转基因技术的安全性、生物武器及蛋白质工程   1．转基因生物的安全性辨析 关注焦点 正方观点 反方观点  食物安全 有安全性评价、科学家负责的态度，转基因食品影响健康，无实例无证据 反对“实质性等同”、出现滞后效应、出现新的过敏原、营养成分改变  生物安全(对生物多样性的影响) 生命力有限、存在生殖隔离、花粉传播距离有限、花粉存活时间有限 扩散到种植区之外变成野生种类、成为入侵外来物种、重组出有害的病原体、成为超级杂草、有可能造成“基因污染”  环境安全(对生态系统稳定性的影响) 不改变生物原有的分类地位、减少农药使用、保护农田土壤环境 打破物种界限、二次污染、重组出有害的病原微生物、毒蛋白等可能通过食物链进入人体  2.生物武器 (1)种类 种类 举例  致病菌 鼠疫菌、霍乱弧菌、伤寒杆菌、炭疽杆菌、痢疾杆菌  病毒 天花病毒、动物痘病毒等  基因重组的致病菌、生化毒剂 如肉毒杆菌毒素可以阻滞神经末梢释放乙酰胆碱，从而引起肌肉麻痹。只要有0.01 mg的肉毒杆菌毒素就可以使人死亡  (2)特点：①传染性强；②污染面广，危害时间长；③难以防治；④具有一定的潜伏期；⑤受自然条件影响大。 (3)传播途径：①经食物和水传播；②空气传播；③接触传播；④虫媒传播；⑤病原体直接传播。 3．蛋白质工程的过程和实例 (1)蛋白质工程的过程：其基本途径是从预期的蛋白质功能出发―→设计预期的蛋白质结构―→推测应有的氨基酸序列―→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)。其流程图如下：
(2)蛋白质工程的实例：①通过蛋白质工程改造的干扰素可在－70 ℃条件下保存半年。②经过蛋白质工程改造天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶这两种酶后，使玉米体内赖氨酸的含量大大提高。
本考点命题多与基因工程操作及其它生物技术综合起来命制，单独命题一般为选择题，多出现在单科卷中。 【典例3】 (2012·江苏单科，13)下列关于转基因生物安全性的叙述，错误的是(　　)。 A．种植转基因作物应与传统农业种植区隔离 B．转基因作物被动物食用后，目的基因会转入动物体细胞中 C．种植转基因植物有可能因基因扩散而影响野生植物的遗传多样性 D．转基因植物的目的基因可能转入根际微生物 解析　本题主要考查转基因生物安全性的相关问题，种植转基因作物时为了避免基因污染，应与传统农业种植区隔离，故A对；转基因作物被动物食用后，目的基因会被动物消化，不会转入动物体细胞中，故B错；转基因植物有可能将基因扩散至野生植物中，从而影响野生植物的遗传多样性，故C对；转基因植物的目的基因可被微生物利用，故D对。 答案　B
1．(2012·福建理综，32)肺细胞中的let7基因表达减弱，癌基因RAS表达增强，会引发肺癌。研究人员利用基因工程技术将let7基因导入肺癌细胞实现表达，发现肺癌细胞的增殖受到抑制。该基因工程技术基本流程如图1。
图1
图2 请回答下列问题。 (1)进行过程①时，需用________酶切开载体以插入let7基因。载体应有RNA聚合酶识别和结合的部位，以驱动let7基因转录，该部位称为________。 (2)进行过程②时，需用________酶处理贴附在培养皿壁上的细胞，以利于传代培养。 (3)研究发现，let7基因能影响癌基因RAS的表达，其影响机理如图2。据图分析，可从细胞中提取________进行分子杂交，以直接检测let7基因是否转录。肺癌细胞增殖受到抑制，可能是由于细胞中________(RAS mRNA/RAS蛋白)含量减少引起的。 解析　此题考查基因工程应用的相关知识。(1)构建基因表达载体时，需要用同种限制酶切割目的基因和载体，使之产生相同的黏性末端。载体应有启动子、终止子和标记基因，其中启动子是RNA聚合酶识别和结合部位，驱动基因转录。(2)动物细胞培养时，常用胰蛋白酶处理贴壁的细胞，使之相互分离，以利于传代培养。(3)检验目的基因是否表达，常用分子杂交技术。从被导入目的基因的细胞内提取RNA，与目的基因单链杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已转录。由图2知，当let7基因转录出来的miRNA与癌基因RAS转录出的mRNA杂交时，就会抑制RAS蛋白的产生，故肺癌细胞增殖受到抑制，可能是由于细胞中RAS蛋白含量减少引起的。 答案　(1)限制性核酸内切(或限制)　启动子　(2)胰蛋白　(3)RNA　RAS蛋白 2．(2012·天津理综，8)黄曲霉毒素B1(AFB1)存在于被黄曲霉菌污染的饲料中，它可以通过食物链进入动物体内并蓄积，引起癌变。某些微生物能表达AFB1解毒酶，将该酶添加在饲料中可以降解AFB1，清除其毒性。 回答下列问题。 (1)AFB1属于____________类致癌因子。 (2)AFB1能结合在DNA的G上，使该位点受损伤变为G*，在DNA复制中，G*会与A配对。现有受损伤部位的序列为，经两次复制后，该序列突变为____________________。 (3)下图为采用基因工程技术生产AFB1解毒酶的流程图：
据图回答问题。 ①在甲、乙条件下培养含AFB1解毒酶基因的菌株，经测定，甲菌液细胞密度小、细胞含解毒酶；乙菌液细胞密度大、细胞不含解毒酶。过程Ⅰ应选择________菌液的细胞提取总RNA，理由是________________________________________________________________________。 ②过程Ⅱ中与引物结合的模板是________。 ③检测酵母工程菌是否合成了AFB1解毒酶，应采用______________方法。 (4)选取不含AFB1的饲料和某种实验动物为材料，探究该AFB1解毒酶在饲料中的解毒效果。实验设计及测定结果见下表： 组别 添加 肝脏AFB1残留量/(ng·g－1)       A 0 0 6.4  B 100 0 20.9  C 100 1 16.8  D 100 3 11.7  E 100 5 7.3  F 100 7 7.3  据表回答问题。 ①本实验的两个自变量分别为________________________________________________________________________。 ②本实验中，反映AFB1解毒酶解毒效果的对照组是 ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 ③经测定，某污染饲料中AFB1含量为100 μg/kg，则每千克饲料应添加________g AFB1解毒酶，解毒效果最好，同时节约了成本。 (5)采用蛋白质工程进一步改造该酶的基本途径是：从提高酶的活性出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的________________________________________________________________________序列。 解析　(1)AFB1是黄曲霉菌产生的一种化学物质，属于化学致癌因子。 (2)根据现在的突变序列可推知当G*不与C配对，只与A配对时，半保留复制两次后会出现与原来序列不同的。 (3)①因为甲菌液细胞中含解毒酶，说明解毒酶基因在甲菌液细胞中可以表达，细胞中一定含有解毒酶基因转录出的mRNA。②PCR扩增过程中，需要的模板是含目的基因的一段DNA，故该过程中模板应该是AFB1解毒酶基因的cDNA。③基因工程的检测与鉴定阶段，在分子水平上需要进行三步检测，其中检测目的基因是否成功表达出蛋白质，所用方法是抗原－抗体杂交法。 (4)①A组作为对照组，与其他几组实验组的区别在于饲料中是否添加AFB1；B组作为对照组与其他几组的区别在于AFB1解毒酶是否添加及添加量的多少。故实验中有两个自变量分别是AFB1添加量和AFB1解毒酶的添加量。 ②B组未添加解毒酶，且与其他几组实验组进行相同饲养，故B组为对照组。 ③由表格中数据可知当污染饲料中AFB1含量为100 μg/kg时，每千克饲料中添加5 gAFB1解毒酶效果与添加7 g等效且最好，因此添加5 g效果最好，且成本最低。 (5)蛋白质工程的基本步骤是，从预期的蛋白质功能出发，设计预期蛋白质的结构，推测应有的氨基酸序列，找出相对应的脱氧核苷酸序列。 答案　(1)化学　(2)　(3)①甲　甲菌液细胞的AFB1解毒酶基因已转录生成mRNA，而在乙菌液细胞中该基因未转录　②AFB1解毒酶基因的cDNA　③抗原－抗体杂交　(4)①AFB1的添加量和AFB1解毒酶的添加量　②B组(或B组＋A组)　③5　(5)脱氧核苷酸
(时间：45分钟) A级　基础演练 1．(2013·温州测试)下列关于基因工程的叙述中，正确的是(　　)。 A．DNA连接酶和RNA聚合酶催化生成的化学键相同 B．DNA连接酶对“缝合”序列不进行特异性识别，无专一性催化特点 C．受体细菌若能表达质粒载体上抗性基因，即表明重组质粒成功导入 D．培育转基因油菜，需对受体细胞进行氯化钙处理 解析　DNA连接酶和RNA聚合酶催化生成的化学键都是磷酸二酯键，故A项正确；酶具有专一性的特点，对于有黏性末端的DNA片段，DNA连接酶只识别连接含有相同黏性末端的DNA片段，故B项错误；有些受体细菌体内本身就含有与质粒上相同的抗性基因，故抗性基因的表达不能作为成功导入的标志，故C项错误；用氯化钙处理大肠杆菌，可增加大肠杆菌细胞壁的通透性，利于重组质粒的导入，对于植物细胞而言，氯化钙不起作用，故D项错误。 答案　A 2．对转基因生物的安全性发生争论，与科学发展水平的限制有密切关系。下面关于基因的相关知识中，不可能是争论的原因的是(　　)。 A．对基因的结构和调控机制等的了解仍相当有限 B．所转移的基因有不少是异种生物之间的基因转移 C．外源基因插入宿主基因组的部位往往是随机的 D．DNA重组技术需要有精心设计的“分子工具” 解析　在DNA重组技术中使用的“分子工具”包括限制性内切酶、DNA连接酶和运载体，人们可以根据需要选择使用，不可能是争论的原因。 答案　D 3．(2013·广东名校质检)下列关于基因成果的概述，错误的是(　　)。 A．在医药卫生方面，主要用于治疗疾病 B．在农业上主要是培育高产、稳产、品质优良和具有抗性的农作物 C．在畜牧养殖业上培育出了体型巨大，品质优良的动物 D．在环境保护方面主要用于环境监测和对污染环境的净化 解析　基因成果在医药卫生方面，主要用于生产药物。 答案　A 4．(2013·广东四校联考)将人的干扰素基因通过基因定点突变，使干扰素第17位的半胱氨酸改变成丝氨酸，改造后的干扰素比天然干扰素的抗病毒活性和稳定性显著提高，此项技术属于(　　)。 A．蛋白质工程 B．细胞工程 C．胚胎工程 D．生态工程 解析　蛋白质工程是利用基因工程手段，包括基因的定点突变和基因表达对蛋白质进行改造，以期获得性质和功能更加完善的蛋白质分子。由题意知该技术属于蛋白质工程。 答案　A 5．(2012·广雅中学模拟)以下为形成cDNA过程和PCR扩增过程示意图。据图分析，下列说法正确的是(　　)。
A．催化①过程的酶是RNA聚合酶 B．④过程发生的变化是引物与单链DNA结合 C．催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶，都能耐高温 D．如果RNA单链中A与U之和占该链碱基含量的40%，则一个双链DNA中，A与U之和也占该DNA碱基含量的40% 解析　由题意可知，①②③④⑤分别表示逆转录、DNA的复制、DNA解旋、引物结合到单链DNA及互补链的合成。①过程由逆转录酶催化完成，A错；由以上分析知B正确；催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶，过程⑤是在70～75 ℃的高温条件下进行的，只有该过程中的酶需耐高温，C错；在DNA分子中有T无U，D错。 答案　B 6．如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性核酸内切酶。下列说法错误的是(　　)。
A．图示过程是基因工程的核心步骤 B．表达载体构建时需要用到限制酶 SmaⅠ C．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来 D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构 解析　图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤。构建过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ。抗卡那霉素基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞。基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等。 答案　B 7．(2011·海南单科，31)回答有关基因工程的问题。 (1)构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后，可能产生黏性末端，也可能产生________末端。若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生________(相同、不同)黏性末端的限制酶。 (2)利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是________。在用表达载体转化大肠杆菌时，常用________处理大肠杆菌，以利于表达载体进入；为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNA，可用标记的胰岛素基因片段作探针与mRNA杂交，该杂交技术称为________。为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成________，常用抗原—抗体杂交技术。 (3)如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的________中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的________上。 解析　(1)DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列的中心轴两侧将DNA切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中心轴线切开时，产生的是平末端。要使目的基因和质粒直接进行连接，应使用同种限制酶切割目的基因和质粒，使二者产生相同黏性末端。(2)一个基因表达载体的组成，除含有目的基因外，还必须有启动子、终止子和标记基因。启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因首端，是RNA聚合酶识别和结合部位，可以驱动目的基因转录出mRNA。在用表达载体转化大肠杆菌时，为便于表达载体进入，常用CaCl2处理大肠杆菌。要检测目的基因是否转录出对应的mRNA，可采用分子杂交技术，即用目的基因片段作探针，与mRNA杂交，如果显示出杂交带，则表明目的基因转录出了mRNA。(3)运用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞时，要先将目的基因插入农杆菌Ti质粒的TDNA中，然后将该农杆菌感染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入到植物细胞的染色体DNA上。 答案　(1)平　相同　(2)驱动胰岛素基因转录出mRNA　CaCl2溶液(或Ca2＋)　分子杂交技术　蛋白质 (3)TDNA　染色体DNA B级　智能提升 8．(新题快递)请阅读下列几段文字后回答问题。 资料1　有人把蚕的DNA分离出来，用一种酶“剪切”下制造丝蛋白的基因，再从细菌细胞中提取一种叫“质粒”的DNA分子，把它和丝蛋白基因拼接在一起再送回细菌细胞中，结果，此细菌就有生产蚕丝的本领。 资料2　法国科学家发现，玉米、烟草等植物含有类似人体血红蛋白的基因，如加入“Fe”原子，就可以制造出人的血红蛋白，从而由植物提供医疗中所需要的人体血液。 (1)所有这些实验统称为________工程，所有这些实验的结果，有没有生成前所未有的新型蛋白质？________。 (2)资料1中实验结果的细菌能生产蚕丝，说明________。在将质粒导入大肠杆菌时，一般要用________处理该菌，以使之处于________细胞状态，以便吸收周围环境中的DNA分子。 (3)资料2中由玉米、烟草的基因生产人类血红蛋白为什么要加入“Fe”原子？________________________________________________________________________。 植物中含类似人类血红蛋白基因，从进化上看，说明________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 解析　(1)这些实验统称为基因工程，生产的蛋白质都是自然界已有的。基因工程不能生产自然界没有的蛋白质，只能生产自然界已有的蛋白质。(2)细菌能生产蚕丝，说明蚕的丝蛋白基因在细菌体内能够表达。将质粒导入细菌时，一般需将Ca2＋处理细菌，使之处于感受态，以便吸收周围环境中的DNA分子。(3)由于血红蛋白中含有Fe2＋，所以由玉米、烟草基因生产人类血红蛋白时要加入“Fe”原子。由于不同的生物能够生产出相同的物质，从进化上看，说明不同的生物之间具有一定的亲缘关系。 答案　(1)基因　没有　(2)蚕的丝蛋白基因在细菌体内得以表达　Ca2＋　感受态　(3)人类的血红蛋白是一种含Fe2＋的特殊蛋白质　不同生物之间具有一定的亲缘关系 9．(新题快递)人外周血单核细胞能合成白介素2(IL～2)。该蛋白可增强机体免疫功能，但在体内易被降解。研究人员将IL－2基因与人血清白蛋白(HSA)基因拼接成一个融合基因，并在酵母菌中表达，获得具有IL－2生理功能、且不易降解的IL－2－HSA融合蛋白。其技术流程如图。请回答下列问题。
(1)培养人外周血单核细胞的适宜温度为________℃；图中②表示________过程。 (2)表达载体1中的位点________，应为限制酶BglⅡ的识别位点，才能成功构建表达载体2。 (3)表达载体2导入酵母菌后，融合基因转录出的mRNA中，与IL－2蛋白对应的碱基序列不能含有________(起始、终止)密码子，才能成功表达出IL－2－HSA融合蛋白。 (4)应用____________杂交技术可检测酵母菌是否表达出IL－2－HSA融合蛋白。 解析　(1)人体的体温是37 ℃左右，因此培养人体细胞的最适宜温度就是37 ℃。由mRNA到cDNA过程是逆转录过程。(2)根据图解可知目的基因的两端分别是由限制酶EcoR I、BglⅡ切割的，一般用同一限制酶切割才能形成相同的黏性末端，表达载体1中的位点a具有EcoR I的识别位点，因此位点a应为限制酶Bgl Ⅱ的识别位点，才能成功构建表达载体2。(3)mRNA中如果含有终止密码子，则会导致翻译终止，不能合成出目的蛋白。(4)抗原、抗体的结合具有特异性，抗原—抗体杂交技术可以迅速检测出酵母菌是否表达出IL－2－HSA融合蛋白。 答案　(1)37(或36.5±0.5)　反(或逆)转录　(2)a (3)终止　(4)抗原—抗体 10．(新题快递)ch1L基因是蓝细菌(蓝藻)DNA上控制叶绿素合成的基因，为研究该基因对叶绿素合成的控制，需要构建该种生物缺失ch1L基因的变异株细胞。技术路线如图甲所示，请据图分析回答问题。
(1)与真菌相比较，蓝细菌在结构上最主要的特点是________，在功能上最主要的特点是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (2)①②过程中均使用的工具酶有________________________________________________________________________。 (3)构建重组质粒B在整个操作过程中的目的是______________和________。 (4)若含有ch1L基因的DNA片段和选用的质粒上的限制酶切割位点如图乙所示。请回答问题。
①构建含ch1L基因的重组质粒A时，应选用的限制酶是________，对________进行切割。 ②同时用酶1和酶4切割图乙中的质粒，则产生含有1 800对碱基和8 200对碱基的两种片段；用图中四种酶同时切割此质粒，则产生含有600对碱基和8 200对碱基的两种片段；若换用酶1和酶3同时切割此质粒，则产生________________________________________________________________________。 解析　(1)蓝细菌为原核生物，与真核生物相比最主要的特点是无核膜包被的细胞核。从功能上分析，蓝细菌有光合色素能够进行光合作用。(4)含ch1L基因的DNA片段没有酶4的切割位点，其中酶2的切割位点在ch1L基因中，所以只能用酶1和酶3同时切割含ch1L基因的DNA片段和质粒。用酶1和酶4切割质粒，质粒被切成l 800对碱基和8 200对碱基的两种片段，说明酶1―→酶2―→酶3―→酶4，总长为1 800对碱基；用四种酶同时切割得到600对碱基和8 200对碱基的两种片段，说明酶1―→酶2，酶2―→酶3，酶3―→酶4，长度均为600对碱基。故用酶1和酶3同时切割质粒，产生含有1 200对碱基和8 800对碱基的两种片段。 答案　(1)没有核膜包被的细胞核　能够进行光合作用 (2)限制性核酸内切酶和DNA连接酶　(3)破坏ch1L基因　操作成功后筛选出该变异株　(4)①酶1和酶3　质粒和含ch1L基因的DNA　②含有1 200对碱基和8 800对碱基的两种片段 11．(2012·新题快递)用小鼠进行DNA重组研究中形成的“基因敲除”技术，能“敲除”DNA分子上的特定基因。该技术的主要过程如下： 第一步：分离小鼠胚胎干细胞，这些细胞中含有需要改造的基因，称“靶基因”。 第二步：获取与“靶基因”同源的DNA片段，利用特定技术在该DNA片段上插入neoR基因(新霉素抗性基因)成为突变DNA(如图)，使该片段上的靶基因失活。 第三步：将插入neoR基因(新霉素抗性基因)的靶基因转移入胚胎干细胞，再通过同源互换，用失活靶基因取代两个正常靶基因中的一个，完成对胚胎干细胞的基因改造。 第四步：将第三步处理后的胚胎干细胞，转移到特定培养基中筛选培养。 其基本原理如下图所示：
(1)第二步中neoR基因插入靶基因使用的工具酶是________。neoR基因不仅能使靶基因失活，还是________；“靶基因失活”的含义是__________________。 (2)从研究者成功获得如上图所示的“敲除”一个靶基因的胚胎干细胞，到将该细胞培育成“基因敲除”小鼠，运用到的生物技术有________、________、________等。 (3)科学家可以通过“基因敲除”技术来治疗疾病，上题中获得的基因敲除小鼠，能否直接用来研究基因功能并说明原因________，________________________________________________________________________。 解析　(1)将neoR基因插入靶基因需要用限制酶处理获得相同的黏性末端，再加入DNA连接酶进行连接，故使用的工具酶是基因工程中的限制酶、DNA连接酶；neoR基因是新霉素抗性基因，可作为标记基因；“靶基因失活”的含义是靶基因不能正常表达。(2)获得如题图所示的“敲除”一个靶基因的胚胎干细胞到该细胞培育成“基因敲除”小鼠需用到克隆技术、转基因技术和细胞培养技术。(3)因为该小鼠体内仍有一个正常的靶基因，能表达性状，故不能得到靶基因的功能，因而不能直接用来研究基因功能。 答案　(1)限制酶、DNA连接酶　标记基因　靶基因不能正常表达　(2)克隆技术　转基因技术　细胞培养技术　(3)不能　因为该小鼠体内仍有一个正常的靶基因，也能表达性状，故不能得到靶基因的功能 特别提醒：教师配赠习题、课件、视频、图片、文档等各种电子资源见《创新设计·高考总复习》光盘中内容。

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