一、基因工程的基本工具[判断正误]
(1)限制酶只能用于切割目的基因。(×)
(2)限制酶切割DNA分子具有特异性。(√)
(3)限制酶切割DNA后可产生黏性末端和平末端两种类型。(√)
(4)DNA连接酶能将两碱基间通过形成氢键连接起来。(×)
(5)E·coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。(×)
(6)质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体。(√)
(7)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达。(√)
二、基因工程的操作程序
三、蛋白质工程[判断正误]
(1)蛋白质工程可按照人的意愿生产出自然界中不存在的蛋白质。(√)
(2)人类主要通过直接改造蛋白质的结构来生产新的蛋白质。(×)
(3)蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程。(√)
[知识体系构建]
①限制性核酸内切酶 ②DNA连接酶 ③基因进入受体细胞的载体 ④从基因文库中获取 ⑤目的基因的获取 ⑥基因表达载体的构建 ⑦农杆菌转化法 ⑧目的基因的导入 ⑨目的基因检测 ⑩目的基因的检测与鉴定 ?提高农作物抗逆能力 ?生产基因工程药物,?设计蛋白质结构 ?找到对应的基因
DNA重组技术的基本工具
(1)(2012·四川卷 T2B)将大肠杆菌的质粒连接上人生长激素的基因后，大肠杆菌获得的能产生人生长激素的变异可以遗传。(√)
(2)(2012·浙江卷T6C)利用DNA聚合酶将控制蓝色色素合成的基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞 。(×)
(3)(2010·大纲全国卷ⅡT5B)将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株。(√)
(4)(2011·浙江卷T6B)每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点。(√)
(5)(2010·浙江卷T2A)用限制性核酸内切酶可以切割烟草花叶病毒的核酸。(×)
(6)(2009·浙江卷T3B)限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶。(√)
1．与DNA分子相关的酶
(1)几种酶的比较：
种类
项目
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
解旋酶
作用底物
DNA分子
DNA分子片段
脱氧核苷酸
DN A分子
作用部位
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
碱基对间的氢键
作用特点
切割目的基因及载体，能专一性识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上
将DNA两条链之间的氢键打开
作用结果
形成黏性末端或平末端
形成重组DNA分子
形成新的DNA分子
形成单链DNA分子
(2)限制酶与DNA连接酶的关系：
①限制酶不切割自身DNA的原因是：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
②DNA连接酶起作用时不需要模板。
2．载体
(1)作用：
①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。
②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
(2)具备的条件：
①能在宿主细胞内稳定保存并大量复制。
②有多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。
③具有特殊的标记基因，以便进行筛选。
(3)种类：
①质粒：一种祼露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，能够自我复制的很小的双链环状DNA分子；
②λ噬菌体的衍生物；
③动植物病毒。
[关键一点]
(1)一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造。
(2)限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。
(3)为使目的基因与载体形成相同的DNA片段末端以便连接，通常使用同一种限制酶将二者切割，但如果不同限制酶切割DNA分子所产生的末端也存在互补关系时，则两末端也可连接。
高考地位
三种基本工具的作用涉及基因工程操作程序的关键步骤，是近几年高考考查的频率考点
命题角度
结合图解分析限制酶的切割位点和目的基因、质粒的结构，分析构建基因表达载体的实例，如典例1。
[典例1] (2010·江苏高考)下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：
限制酶
BamHⅠ
HindⅢ
EcoRⅠ
SmaⅠ
识别序列及切割位点
↓
GGATCC
CCTAGG
↑
↓
AAGCTT
TTCGAA
↑
↓
GAATTC
CTTAAG
↑
↓
CCCGGG
GGGCCC
↑
(1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有________个游离的磷酸基团。
(2)若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越________。
(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是________________________________________________________________________。
(4)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止________________。
(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入________酶。
(6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了_______________________________。
(7)为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在________的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。
[解析] 本题考查基因工程的限制性内切酶的作用特点。
(1)质粒切割前是双链环状DNA分子，所有磷酸基团参与形成磷酸二酯键，故不含游离的磷酸基因。从图1可以看出，质粒上只含有一个SmaⅠ的切点，因此被该酶切割后，质粒变为线性双链DNA分子，因每条链上含有一个游离的磷酸基团，因此切割后含有两个游离的磷酸基团。
(2)由题目可知，SmaⅠ识别的DNA序列只有G和C，而G和C之间可以形成三个氢键，所以SmaⅠ酶切位点越多，热稳定性就越高。
(3)质粒抗生素抗性基因为标记基因，由图2可知，标记基因和外源DNA目的基因中均含有SmaⅠ酶切位点，都可以被SmaⅠ破坏，故不能使用该酶剪切质粒和含有目的基因的DNA。
(4)只使用EcoRⅠ，则质粒和目的基因两端的黏性末端相同，用连接酶连接时，会产生质粒和目的基因自身连接物，而利用BamHⅠ和HindⅢ剪切时，质粒和目的基因两端的黏性末端不同，用DNA连接酶连接时，不会产生自身连接产物。
(5)质粒和目的基因连接后获得重组质粒，该过程需要连接酶作用，故混合后加入DNA连接酶。
(6)质粒上的抗性基因为标记基因，用于鉴别和筛选含有重组质粒的受体细胞。
(7)目的基因为蔗糖转运蛋白基因，所用的受体细胞为丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，若将重组质粒导入了受体细胞，则受体细胞应能从培养基中吸收蔗糖，故应在以蔗糖为唯一碳源的培养基上进行培养。
[答案] (1)0、2 (2)高 (3)SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因 (4)质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化 (5)DNA连接 (6)鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞 (7)蔗糖为唯一含碳源
基因工程的基本操作程序及与蛋白质工程的比较
(1)(2011·四川卷T5D)应用DNA探针技术可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达。(×)
(2)(2010·大纲全国卷ⅡT5D)自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上，属于基因工程。(×)
(3)(2010·江苏卷T18B)转抗虫基因的植物，不会导致昆虫群体抗性基因频率增加。(×)
(4)(2010·江苏卷T18C)动物的生长激素基因转入植物后不能表达。(×)
(5) (2011·江苏卷T14A)蛋白质工程可合成自然界中不存在的蛋白质。(√)
1．基因工程的操作程序分析
(1)目的基因的获取途径：
①从自然界中已有的物种中分离出来，如从基因文库或cDNA文库中获取；
②人工合成目的基因：常用的方法有反转录法和化学合成法；
③利用PCR技术扩增目的基因：通过PCR技术可对已获取的目的基因进行扩增，以获取大量的目的基因。
(2)基因表达载体的构建：
[关键一点]
(1)插入的目的基因的表达需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入基因部位之前需有启动子，之后需有终止子。
(2)两次使用的限制酶为同一种酶，这样形成的黏性末端碱基之间互补，便于连接。
(3)将目的基因导入受体细胞(转化)：
生物种类
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法
显微注射技术
Ca2＋处理法
受体细胞
体细胞
受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入Ti质粒的TDNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
(4)目的基因的检测与鉴定：
类型
检测内容
方法
结果显示
分子检测
导入检测
目的基因是否进入受体细胞
DNA分子杂交
(DNA和DNA之间)
杂交带
转录检测
目的基因是否转录出mRNA
分子杂交(DNA和mRNA之间)
杂交带
翻译
检测
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原－抗体杂交
杂交带
个体水平检测
包括做抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；对基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能活性是否相同等
2．基因工程与蛋白质工程的比较
项目
区别与联系
蛋白质工程
基因工程
区别
过程
预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列
获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质
定向改造或生产人类所需的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结果
可生产自然界没有的蛋白质
只能生产自然界已有的蛋白质
联系
①蛋白质工程是在基因工程基础上，延伸出来的第二代基因工程；
②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造
高考地位
基因工程的基本操作程序是近几年高考的高频考点，分值比重较大，对基因工程和蛋白质工程的基本原理和应用的考查也逐渐增多，与其他工程结合考查的情况较常见，考查形式既有非选择题又有选择题
命题角度
(1)考查将目的基因导入受体细胞的方法、基因工程过程中的筛选及目的基因的检测与鉴定方法的相关知识，如典例2；
(2)通过与其他工程技术综合考查学生解决实际问题的能力，如典例3。
[典例2] 下图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性核酸内切酶。下列说法错误的是( )
A．图示过程是基因工程的核心步骤
B．表达载体构建时需要用到限制酶 SmaⅠ
C．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
[解析] 选B 图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤。构建过程中需要将目的基因完整切割下来，而限制酶SmaⅠ的切割位点在目的基因上，使SmaⅠ会破坏目的基因。抗卡那霉素基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞。基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等。
[典例3] (2013·淮安调研)下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资料，请分析回答下列问题：
资料1：巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源，此时AOX1基因受到诱导而表达【5’AOX1和3’AOX1(TT)分别是基因AOX1的启动子和终止子】。
资料2：巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以科学家改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。
资料3：限制酶酶切位点
限制酶
SnaB Ⅰ
Avr Ⅱ
Sac Ⅰ
Bgl Ⅱ
识别序列及酶切位点
↓
…TACGTA…
…ATGCAT…
↑
↓
…CCTAGG…
…GGATCC…
↑
↓
…CAGCTC…
…CTCGAG…
↑
↓
…AGATCT…
…TCTAGA…
↑
(1)如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在HBsAg基因两侧的A和B位置接上________、______限制酶识别序列， 这样设计的优点是避免质粒和目的基因自身环化。
(2)酶切获取HBsAg基因后，需用________将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取________。
(3)步骤3中应选用限制酶________来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。
(4)为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入卡拉霉素以便筛选，转化后的细胞中是否含有HBsAg基因，可以用________方法进行检测。
(5)转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入________以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。
(6)与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行________并分泌到细胞外，便于提取。
[解析] (1)重组质粒上的目的基因若要表达，需目的基因的首尾含有启动子和终止子。而SnaB 、AvrⅡ识别的序列在启动子与终止子之间，所以只有在目的基因两侧A和B位置分别接上这两种序列，并用SnaBⅠ、AvrⅡ这两种内切酶对质粒和目的基因同时切割，才会既各自出现相同的黏性末端，便于重组与表达，又可防止环化。
(2)用DNA连接酶将切割后的HBsAg基因和pPIC9K质粒连接成重组质粒，导入大肠杆菌体内，目的是利用大肠杆菌无性繁殖速度，短时间内可获取大量的重组质粒。
(3)重组DNA的两侧分别是启动子和终止子，除BglⅡ外，其它限制酶会破坏含有启动子、终止子的目的基因。
(4)用DNA分子杂交技术检测是否导入目的基因。
(5)资料1显示，甲醇为该酵母菌的唯一碳源，同时诱导HBsAg基因表达。
(6)酵母菌为真核生物，细胞内具有对分泌蛋白加工的内质网和高尔基体等细胞器，细菌等原核生物，不具有内质网和高尔基体等细胞器。
[答案] (1)SnaB AvrⅡ
(2)DNA连接酶 大量重组质粒
(3)BglⅡ
(4)DNA分子杂交
(5)甲醇
(6)加工(修饰)
[高考随堂体验]
1．(2012·新课标全国卷)根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)限制性内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有________和________。
(2)质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：
AATTC……G
G……CTTAA
为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的特点是________________________________
________________________________________________________________________。
(3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即________DNA连接酶和________DNA连接酶。
(4)反转录作用的模板是________，产物是________。若要在体外获得大量反转录产物，常采用________技术。
(5)基因工程中除质粒外，________________和________________也可作为运载体。
(6)若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是________________________。
解析：(1)DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种——黏性末端和平末端。(2)为了保证目的基因与运载体相连，用另一种限制酶切割后形成的黏性末端必须与EcoRⅠ切割形成的黏性末端相同。(3)DNA连接酶有大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶两类。(4)反转录的模板是mRNA，产物是DNA。大量扩增反转录产物常采用PCR技术。(5)在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。(6)经Ca2＋处理后处于感受态的大肠杆菌才易吸收周围环境中的DNA分子。
答案：(1)黏性末端 平末端 (2)切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的相同 (3)大肠杆菌 T4 (4)mRNA(或RNA) cDNA(或DNA) PCR (5)噬菌体 动植物病毒 (6)未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱
2．(2012·海南高考)已知甲种农作物因受到乙种昆虫危害而减产，乙种昆虫食用某种原核生物分泌的丙种蛋白质后死亡。因此，可将丙种蛋白质基因转入到甲种农作物体内，使甲种农作物获得抗乙种昆虫危害的能力。
回答下列问题：
(1)为了获得丙种蛋白质的基因，在已知丙种蛋白质氨基酸序列的基础上，推测出丙种蛋白质的________序列，据此可利用________方法合成目的基因。获得丙中蛋白质的基因还可用________、________方法。
(2)在利用上述丙种蛋白质基因和质粒载体构建重组质粒的过程中，常需使用________酶和________酶。
(3)将含有重组质粒的农杆菌与甲种农作物的愈伤组织共培养，筛选出含有丙种蛋白质的愈伤组织，由该愈伤组织培养成的再生植株可抵抗________的危害。
(4)若用含有重组质粒的农杆菌直接感染甲种农作物植株叶片伤口，则该植株的种子________(填“含有”或“不含”)丙种蛋白质基因。
解析：(1)在已知蛋白质的氨基酸序列的情况下，可根据氨基酸和碱基的对应关系，推出合成该蛋白质的基因序列，然后用DNA合成仪通过化学方法来合成目的基因。此外也可以通过从基因文库中和PCR这两种方法获取目的基因。
(2)构建重组质粒时，需要用限制酶将运载体切开，并用DNA连接酶将目的基因连接到运载体上，从而构建基因表达载体。
(3)愈伤组织中含有丙蛋白，说明丙蛋白的基因在甲种农作物体内得到了表达，而乙昆虫食用丙蛋白后会死亡，故该植株可抵抗乙昆虫的危害。
(4)用含有重组质粒的农杆菌直接感染甲种农作物植株叶片伤口，仅仅在该叶片内部分细胞中能合成丙蛋白，该植株的种子和其他的营养器官均不含有重组质粒，也就不含有丙种蛋白质的基因。
答案：(1)基因 化学 基因文库 PCR(其他合理答案也可)
(2)限制 DNA连接
(3)乙种昆虫
(4)不含
3．(2012·江苏高考)图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：
(1)图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由________连接。
(2)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是________末端，其产物长度为________________________________________________________________________。
(3)若图1中虚线方框内的碱基对被T－A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有________种不同长度的DNA片段。
(4)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是________。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加________的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是________________________________________________________________________
____________________________________。
解析：(1)一条脱氧核苷酸链中相邻的两个碱基之间是通过“—脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖—”相连的。(2)从SmaⅠ的识别序列和酶切位点可知，其切割后产生的是平末端，图1中DNA片段有两个SmaⅠ的识别序列，故切割后产生的产物长度为534＋3＝537(bp)、796－3－3＝790(bp)和658＋3＝661(bp)的3个片段。(3)图示方框内发生碱基对的替换后，形成的d基因失去了1个SmaⅠ的识别序列，故D基因、d基因用SmaⅠ完全切割所得产物中除原有D基因切割后的3种长度的DNA片段外，还增加一种d基因被切割后出现的长度为537＋790＝1 327(bp)的DNA片段。(4)目的基因的两端都有BamHⅠ的识别序列，质粒的启动子后抗生素A抗性基因上也有BamHⅠ的识别序列，故应选用的限制酶是BamHⅠ，此时将抗生素B抗性基因作为标记基因，故筛选时培养基中要添加抗生素B。经过同种限制酶切割后会产生相同的末端，可能发生部分目的基因与质粒的反向连接，导致基因无法正常表达。
答案：(1)脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖
(2)平 537 bp、790 bp、661 bp
(3)4
(4)BamH Ⅰ 抗生素B 同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接
4．(2012·天津高考)生物分子间特异性结合的性质广泛用于生命科学研究。以下实例为体外处理“蛋白质—DNA复合体”获得DNA片段信息的过程图。
据图回答：
(1)过程①酶作用的部位是________键，此过程只发生在非结合区DNA。过程②酶作用的部位是________键。
(2)①、②两过程利用了酶的________特性。
(3)若将得到的DNA片段用于构建重组质粒，需要将过程③的测序结果与________酶的识别序列进行比对，以确定选用何种酶。
(4)如果复合体中的蛋白质为RNA聚合酶，则其识别、结合的DNA序列区为基因的________。
(5)以下研究利用了生物分子间特异性结合性质的有________(多选)。
A．分离得到核糖体，用蛋白酶酶解后提取rRNA
B．用无水乙醇处理菠菜叶片，提取叶绿体基粒膜上的光合色素
C．通过分子杂交手段，用荧光物质标记的目的基因进行染色体基因定位
D．将抑制成熟基因导入番茄，其mRNA与催化成熟酶基因的mRNA互补结合，终止后者翻译，延迟果实成熟
解析：(1)连接DNA片段的化学键是磷酸二酯键；氨基酸通过肽键连接形成肽链。(2)DNA酶催化DNA的水解，蛋白酶催化蛋白质的水解，这体现了酶的专一性。(3)目的基因上应该具有限制性核酸内切酶的识别序列。(4)RNA聚合酶和基因上的启动子发生特异性结合，启动并进行转录过程。(5)A选项体现了蛋白酶和蛋白质间的特异性结合；C选项体现了DNA链之间的A与T、C与G间的特异性结合；D选项体现了RNA链之间的A与U、C与G间的特异性结合。
答案：(1)磷酸二酯 肽 (2)专一性 (3)限制性核酸内切
(4)启动子(或转录起始区) (5)A、C、D
5．(2012·福建高考)肺细胞中的let -7基因表达减弱，癌基因RAS表达增强，会引发肺癌。研究人员利用基因工程技术将let -7基因导入肺癌细胞实现表达，发现肺癌细胞的增殖受到抑制。该基因工程技术基本流程如图1。
请回答：
(1)进行过程①时，需用________酶切开载体以插入let -7基因。载体应有RNA聚合酶识别和结合的部位，以驱动let-7基因转录，该部位称为____________。
(2)进行过程②时，需用____________酶处理贴附在培养皿壁上的细胞，以利于传代培养。
(3)研究发现，let -7基因能影响癌基因RAS的表达，其影响机理如图2。据图分析，可从细胞中提取________进行分子杂交，以直接检测let -7基因是否转录。肺癌细胞增殖受到抑制，可能是由于细胞中________(RASmRNA/RAS蛋白)含量减少引起的。
解析：(1)过程①为基因表达载体的构建，该过程涉及的工具酶为限制性核酸内切酶和DNA连接酶，需用限制酶切开载体以插入let -7基因。完整的基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等，而启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点。(2)进行过程②时，用胰蛋白酶处理贴附在培养皿壁上的细胞，以利于细胞的传代培养。(3)从图中可以看出，RASmRNA和let -7基因转录的miRNA配对形成杂交分子，从而抑制了癌基因RAS的表达，导致RNS蛋白减少，故可以提取RNA进行分子杂交，以直接检测let -7基因是否转录。
答案：(1)限制性核酸内切(或限制) 启动子
(2)胰蛋白
(3)RNA RAS蛋白
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