一、DNA的粗提取与鉴定 1．提取原理 DNA与杂质的溶解度不同，DNA与杂质对酶、高温、洗涤剂的耐受性不同。 2．实验设计 (1)材料的选取：选用DNA含量相对较高的生物组织，如鸡血、菜花、洋葱等。 (2)破碎细胞(以鸡血为例)：鸡血细胞，加蒸馏水，用玻璃棒搅拌，用纱布过滤，收集滤液。 (3)去除杂质：利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质。 (4)DNA析出：将处理后的溶液过滤，加人与滤液体积相等的、冷却的酒精溶液(体积分数为95%)。 3．DNA的鉴定 DNA溶解在2 mol/L的NaCl溶液中，加入4 mL的二苯胺试剂，沸水中加热5 min，溶液变成蓝色。 二、多聚酶链式反应扩增DNA片段 1．PCR原理 DNA热变性原理，即：  2．PCR反应过程 (1)变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。 (2)复性：温度下降到55℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 (3)延伸：温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 三、血红蛋白的提取和分离 1．蛋白质的分离方法[判断正误] (1)利用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量小的先洗脱出来。 (×) (2)在电泳过程中，蛋白质分子的移动速度，与分子本身的大小和形状无关，而与所带电荷的差异有关。 (×) (3)在SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳中，电泳迁移速率完全取决于分子的大小。 (√) 2．血红蛋白的分离过程  ↓  ↓  [知识体系构建]
①NaCl溶液　②DNA热变性　③引物、模板、原料、耐高温的DNA聚合酶等　 ④电泳法　⑤二苯胺　⑥复性

DNA的粗提取与鉴定  
(1)(2009·江苏卷T23A)提取细胞中的DNA和蛋白质都需用蒸馏水涨破细胞。(×) (2)(2011·江苏卷T19D改编)用菜花替代鸡血作为实验材料进行“DNA的粗提取与鉴定”，其实验操作步骤相同。(×) (3)(2009·江苏卷T23B)用不同浓度NaCl溶液反复溶解与析出DNA可去除蛋白质。(√) (4)(2009·江苏卷T23C)蛋白质提取和分离过程中进行透析可去除溶液中的DNA 。(×) (5)(2011·江苏卷T19C)利用鸡血进行“DNA的粗提取与鉴定”的实验中，将丝状物溶解在2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色。(×)
1．基本原理
2．DNA与蛋白质在NaCl溶液中溶解度比较 NaCl溶液 0.14 mol/L NaCl溶液 溶解规律  DNA 溶解 析出 
 蛋白质 部分发生盐析沉淀 溶解 NaCl溶液从2 mol/L降低过程中，溶解度逐渐增大   3．操作过程  ↓  ↓  ↓  ↓  [关键一点] (1)本实验不能用哺乳动物成熟红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟红细胞无细胞核。 (2)实验中两次使用蒸馏水，第一次的目的是使成熟的鸡血细胞涨破释放出DNA，第二次目的是稀释NaCl溶液，使DNA从溶液中析出。 (3)二苯胺试剂要现配现用，否则二苯胺会变成浅蓝色，影响鉴定效果。 4．实验中4次过滤的比较 第一次过滤 第二次过滤 第三次过滤 第四次过滤  滤液中 含DNA的核物质 DNA 溶于0.14 mol/L NaCl溶液的杂质 DN A  纱布上 细胞膜、核膜等残片 不溶于2 mol/L NaCl溶液的杂质 DNA 不溶于2 mol/LNaCl溶液的杂质  过滤前加入的物质 蒸馏水 NaCl溶液 蒸馏水 NaCl溶液  过滤的目的 去除细胞膜、核膜等杂质 去除不溶于2mol/L NaCl的杂质 去除溶于0.14 mol/L NaCl溶液的杂质 去除不溶于2 mol/L NaCl溶液的杂质  
高考地位 DNA粗提取与分离的原理、过程与鉴定是本专题在高考中的主要命题点，但总体来看考查频率不大  命题角度 (1)以非选择题的形式考查DNA粗提取的原理及操作步骤，如典例1； 2.以选择题的形式考查DNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解与析出，DNA的鉴定，如典例2。   [典例1]　 (2013·南昌模拟)下图表示以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取与鉴定的操作程序，请分析回答下列问题：
(1)步骤一中，向鸡血细胞液中加入________并搅拌，可使鸡血细胞破裂。 (2)步骤二中，过滤后收集含有DNA的________。 (3)步骤三、四的操作原理是________________________________________，步骤四通过向溶液中加入________调节NaCl溶液的物质的量浓度为________mol/L时，DNA将会析出，过滤去除溶液中的杂质。 (4)步骤七：向步骤六过滤后的________中，加入等体积的、冷却的________，静置2～3 min，溶液中会出现________色丝状物，这就是粗提取的DNA。 (5)步骤七：DNA遇________试剂，沸水浴5 min，冷却后，溶液呈________色。 [解析]　破碎红细胞应用蒸馏水，使之吸水涨破。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在2 mol/L的NaCl中DNA溶解，在0.14 mol/L的NaCl溶液中，DNA析出。可通过加入蒸馏水将2 mol/L NaCl溶液稀释为0.14 mol/L的NaCl溶液。DNA不溶于冷酒精，遇二苯胺加热呈蓝色反应。 [答案]　(1)蒸馏水　(2)滤液　(3)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质　蒸馏水　0.14　(4)滤液　酒精　白　(5)二苯胺　蓝 [典例2]　下列关于DNA粗提取与鉴定实验中所使用的试剂、操作及作用的表述，不正确的是 (　　) 选项 试剂 操作 作用  A. 柠檬酸钠溶液 与鸡血混合 防止血液凝固  B. 蒸馏水 与鸡血细胞混合 保持细胞形状  C. 蒸馏水 加入到溶解有DNA的2 mol/L的NaCl溶液中 降低NaCl溶液的浓度，使DNA析出  D. 二苯胺试剂 DNA与二苯胺在沸水浴的条件下发生蓝色反应 鉴定DNA   [解析]　选B　蒸馏水在本实验中的作用有两个：一是用于调节NaCl溶液的浓度，以使DNA沉淀析出或溶解；二是用于鸡血细胞的溶血，释放细胞内的核物质。
 多聚酶链式反应扩增DNA片段  
(1)[2010·山东卷·T34(4)]若需克隆脂肪酶基因，可应用耐热DNA聚合酶催化的PCR技术。(√) (2)[2009·广东卷T38(3)]PCR反应包括多次循环，每次循环包括三步： 变性、复性和延伸。(√) (3)(2012·唐山一模)PCR中加入的引物有两种，其作用是使DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸。(×) (4)(2012·临沂一模)DNA变性后，当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链，称为复性，PCR技术利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。(√)
1．细胞内DNA复制与体外DNA扩增(PCR技术)的比较 细胞内DNA复制 PCR  不同点 解旋 解旋酶，边解旋边复制 80～100 ℃高温解旋，双链完全分开   酶 解旋酶，DNA聚合酶，DNA连接酶 Taq DNA聚合酶   引物 RNA DNA或RNA   能量 ATP 不加   温度 体内温和条件 高温   子链合成 一条链连续(先导链)，另一条链不连续，先合成片段，再由DNA连接酶连接(滞后链) 两条子链均连续合成  相同点 ①提供DNA模板； ②四种脱氧核苷酸作原料； ③子链延伸的方向都是从5′端到3′端   2．PCR反应的过程及结果 (1)PCR反应过程： ①变性：当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链，如下图：
②复性：系统温度下降至50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：
③延伸：当系统温度上升至72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：
(2)结果： ①PCR一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、复性、延伸三步。 ②两引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。 [关键一点]　DNA复制需要引物的原因：DNA聚合酶不能从5′端开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。
高考地位 本部分内容在近几年高中命题中较少出现，但考查频率有升高的趋势，多在非选择题的题肢中考查  命题角度 以填空的形式考查PCR技术的原理、过程、条件，如典例3。   [典例3]　PCR(多聚酶链式反应)技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，下图表示合成过程，请据图分析回答：
(1)A过程高温使DNA变性解旋，对该过程的原理叙述正确的是________。 A．该过程用到耐高温的解旋酶破坏氢键 B．该过程用到限制酶破坏磷酸二酯键 C．该过程不需要解旋酶的作用 D．该过程与人体细胞的过程完全相同 (2)C过程要用到的酶是耐高温的________。这种酶在高温下仍保持活性，因此在PCR扩增时可以________________________________________________________________________ 加入，________(需要/不需要)再添加。PCR反应除提供酶外，还需要满足的基本条件有：____________________________________。 (3)如果把模板DNA的两条链用15N标记，游离的脱氧核苷酸不做标记，控制“94℃～55℃～72℃”温度循环3次，则在形成的子代DNA中含有15N标记的DNA占________。 [解析]　(1)高温所起的作用类似于解旋酶，使双链DNA变为单链。(2)C过程是PCR技术的延伸阶段，当系统温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。这种DNA聚合酶在高温下不变性，所以一次性加入即可。(3)PCR技术遵循半保留复制的特点。经过三次循环，共产生23个DNA分子，其中有2个DNA分子含有15N标记。 [答案]　 (1)C　(2)DNA聚合酶　一次　不需要　DNA模板、两种引物、四种脱氧核苷酸，通过控制温度使DNA复制在体外反复进行　(3)25%
 血红蛋白的提取和分离  
(1)(2011·广东卷T5AB)猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少，洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂。(√) (2)(2011·广东卷T5CD) 血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测，在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢。(×) (3)(2009·江苏卷T23D)蛋白质和DNA都可以用电泳的方法进行分离纯化。(√) (4)[2011·山东卷T34(3)]电泳法纯化蛋白质时，若分离带电荷相同的蛋白质，则其相对分子质量越大，电泳速度越快。(×) (5)(2010·江苏卷T3C)利用透析法纯化蛋白酶时，应以蒸馏水作为透析液。(×)
1．方法及原理 方　法 原　理  凝胶色谱法 根据相对分子质量的大小分离蛋白质  电泳法 各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同   2．实验操作程序 (1)样品处理： ①红细胞的洗涤：除去血浆蛋白等杂质，有利于后续步骤的分离纯化； ②血红蛋白的释放：使红细胞破裂，血红蛋白释放出来； ③分离血红蛋白溶液：经过离心使血红蛋白和其他杂质分离开来，便于下一步对血红蛋白的纯化。 (2)粗分离： ①原理：透析袋能使小分子自由出入，而将大分子保留在袋内，透析可以除去样品中相对分子质量较小的杂质。 ②过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。 ③目的 ④图示：
⑤注意：透析时间为12 h。透析袋是用硝酸纤维素制成的，小分子可自由进出，而大分子保留在袋内。 (3)纯化：一般采用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离和纯化。 (4)纯度鉴定：一般用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳方法来测定蛋白质，即对血红蛋白进行纯度鉴定。 3．结果分析与评价 项　目 分　析  血液样品的处理 分层明显→样品处理完成   凝胶色谱柱的装填 放一支与凝胶柱垂直的日光灯→直接检查加入大分子有色物质如蓝色葡聚糖－2 000或红色葡聚糖，若色带均匀、狭窄、平整→装填成功  血红蛋白的分离 血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出→分离成功   [关键一点]　①用凝胶色谱法分离和纯化蛋白质，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 ②在蛋白质分离过程中，应仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况，如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。 ③血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，可大大简化实验操作。
高考地位 本考点近几年高考中多有涉及，但难度不大  命题角度 多围绕蛋白质分子的分离原理、凝胶色谱法、透析原理及电泳法纯化蛋白质等进行考查，如典例4。   [典例4]　已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种蛋白质分子，其分子大小、所带电荷的性质和数量情况如下图所示，下列有关该样品中蛋白质的分离的叙述正确的是(　　) A．将样品装入透析袋中透析12 h，若分子乙保留在袋内，则分子丙也保留在袋内 B．若用凝胶色谱柱分离样品中的蛋白质，则分子甲移动速度最快 C．若将样品以2 000 r/min的速度离心10 min，分子戊存在于沉淀中，则分子甲也存在于沉淀中 D．若用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子，则分子甲和分子戊形成的电泳带相距最远 [解析]　选A　分子甲的分子量最小，进入凝胶内部通道而移动速度慢；分子乙留在透析袋内，说明其相对分子质量比较大，分子丙比分子乙相对分子质量大，所以分子丙也留在袋内；分子戊比分子甲的相对分子质量大，故离心后分子甲可能不存在于沉淀物中； SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳中的样品，其电泳迁移率完全取决于分子的大小，相对分子质量相差越大，形成的电泳带相距越远。
[高考随堂体验] 1．(2012江苏高考)下列关于“DNA粗提取与鉴定实验”的叙述，正确的是 A．洗涤剂能瓦解细胞膜并增加DNA在NaCl溶液中的溶解度 B．将DNA丝状物放入二苯胺试剂中沸水浴后冷却变蓝 C．常温下菜花匀浆中有些酶类会影响DNA的提取 D．用玻棒缓慢搅拌滤液会导致DNA获得量减少 解析：选C　洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质，但不能增大DNA在NaCl溶液中的溶解度；DNA丝状物在二苯胺试剂中沸水浴加热过程中变蓝，不需要冷却；菜花匀浆中含有多种酶，常温下有些酶类可破坏DNA而影响DNA的提取；用玻璃棒缓慢搅拌滤液，有利于提取并防止搅拌时DNA断裂，并不影响DNA的含量。 2．(2011·江苏高考)请回答基因工程方面的有关问题： (1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。
图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。 ①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为________ 。 ②在第________ 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。 (2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。
①第1组：__________________________________________________________； ②第2组：__________________________________________________________ 。 (3) PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的 功能，这是因为_____________________________________________________________ ________________________________________________________________________ 。
解析：(1)①根据PCR过程特点绘制PCR过程示意图如下：
由图可知，以原来的每条母链为模板合成的两个新DNA分子中，只含有引物A或引物B，而以新合成的子链为模板合成新DNA分子时，两种引物都含有，故第四轮循环共产生16个DNA分子，其中含有引物A的分子是15个，占15/16。②由图示知，第一、二轮循环合成的子链长度均不同，根据半保留复制特点，前两轮循环产生的4个DNA分子的两条链均不等长，第三轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链。 (2)引物是单链DNA时才能与DNA结合，而单链DNA的碱基互补配对部分容易形成双链结构而失去其功能。从图示可以看出，①组引物I和引物II局部碱基互补配对，易形成双链结构而失效。②组引物相互间虽不能发生碱基互补配对，但I′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。 (3)DNA聚合酶的作用是将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上，而不能直接将两个脱氧核苷酸连在一起。 答案： (1)①15/16 　②三 (2)①引物I和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 ②引物I′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效 (3) DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上 3．(2010·江苏高考)某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动。具体步骤如下： 材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份。每份l0 g。剪碎后分成两组，一组置于20℃、另一组置于－20℃条件下保存24 h。 DNA粗提取： 第一步：将上述材料分别放入研钵中，各加入l5 mL研磨液，充分研磨。用两层纱布过滤，取滤液备用。 第二步：先向6只小烧杯中分别注入10 mL滤液，再加入20 mL体积分数为95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。 第三步：取6支试管，分别加入等量的2 mol/L NaCl溶液溶解上述絮状物。 DNA检测：在上述试管中各加入4 mL二苯胺试剂，混合均匀后，置于沸水中加热5 min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅，结果如下表。 材料保存温度 花菜 辣椒 蒜黄  20℃ ＋＋ ＋ ＋＋＋  －20℃ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋   (注：“＋”越多表示蓝色越深) 分析上述实验过程，回答下列问题： (1)该探究性实验课题名称是__________________________。 (2)第二步中“缓缓地”搅拌，这是为了减少________________________________________________________________________。 (3)根据实验结果，得出结论并分析。 ①结论1：与20℃相比，相同实验材料在－20℃条件下保存，DNA的提取量较多。结论2：________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 ②针对结论1.请提出合理的解释：________________________________________。 (4)氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，且对DNA影响极小。为了进一步提高DNA纯度，依据氯仿的特性。在DNA粗提取第三步的基础上继续操作的步骤是：____________________________ 。然后用体积分数为95%的冷酒精溶液使DNA析出。 解析：(1)据题意，该探究实验的自变量有实验材料的种类和温度，因变量为DNA提取量，则该探究性实验课题名称是探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响。 (2)搅拌过程中常常会发生DNA的断裂，因而该步骤需要“缓缓地”进行。 (3) ①据表分析不同自变量条件下的因变量情况，则可得结论2：等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄提取的DNA量最多。 ②低温能使DNA酶的活性受到抑制，从而降低了DNA的降解速率，使DNA提取量增多。 (4)根据氯仿的理化性质，可采用氯仿与提取液混合，后去除上清液。 答案：(1)探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响 (2)DNA断裂 (3)①等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄提取的DNA量最多②低温抑制了相关酶的活性，使DNA降解速度减慢 (4)将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混和。静置一段时间，吸取上清液

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