幻灯片 1第4讲 生物技术在其他方面的应用
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幻灯片 2(1)植物的组织培养 (2)蛋白质的提取和分离 (3)PCR技术的基本操作和应用
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幻灯片 3全能性
脱分化
再分化
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幻灯片 4
(4)实验操作步骤：制备MS培养基→外植体消毒→________→培养→________→栽培
(3)影响因素
种类
年龄
微量元素
维生素
甘氨酸
烟酸
生长素
细胞分裂素
5.8
接种
移栽
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幻灯片 5比一比：MS培养基与微生物培养基有何主要不同？
答案：微生物培养基以有机营养为主，MS培养基则需提供大量无机营养，包括植物生长必需的大量元素和微量元素。
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幻灯片 62．月季的花药培养
(1)理论基础：花粉具有________
(2)花粉发育过程： 、________、_________等阶段
(3)产生花粉植株的两种途径：
全能性
四分体时期
单核期
双核期
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幻灯片 7(4)操
作关
键
初花期
完全未开放
单核期(细胞核由中央移向细胞一侧的时期)
醋酸洋红法
焙花青—铬矾法
红
蓝黑
从受伤部位产生愈伤组织
彻底去除花丝
愈伤组织
胚状体
长出愈伤组织
分化培养基上
幼小植株分开
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幻灯片 8看一看：植物组织培养与花药培养技术有何相同与不同？
答案：相同点：培养基配制方法、无菌技术及接种操作等基本相同。
不同点：花药培养的选材非常重要，需要先选择时期适宜的花蕾，花药裂开后释放出的愈伤组织或胚状体也要及时更换培养基，花药培养对培养基配方的要求更为严格。
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幻灯片 9知识点二 蛋白质的提取和分离、PCR技术
1．血红蛋白的提取和分离
(1)凝胶色谱法：也称分配色谱法，是根据 分离蛋白质的方法。相对分子质量较小的移动速度较慢，而相对分子质量较大的无法 ，移动速度较快
(2)缓冲溶液：能够抵制外界的________对溶液pH的影响，维持pH_________
相对分子质量的
大小
进入凝胶内部
酸和碱
基本不变
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幻灯片 10(3)电泳：带电粒子在________的作用下发生迁移的过程
(4)样品处理：红细胞的洗涤→血红蛋白的释放→分离血红蛋白溶液→透析
：凝胶色谱柱的制作→ →样品的加入和洗脱→SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
电场
凝胶色谱操作
凝胶色谱柱的装填
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幻灯片 11思一思：用猪的血液与鸡的血液提取血红蛋白哪个效果更好？
答案：用猪的血液；因为猪的红细胞无细胞核和细胞器，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。
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幻灯片 122．多聚酶链式反应扩增DNA片段
(1)PCR原理：在一定的缓冲溶液中提供 ，分别与两条模板链结合的两种引物， ，同时控制温度使DNA复制在__________反复进行
(2)PCR的反应过程：变性→________→延伸
DNA模板
苷酸、耐热的DNA聚合酶
四种脱氧核
体外
复性
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幻灯片 13菊花茎与月季花药组织培养的比较
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幻灯片 14----
幻灯片 151．引物是指能够与DNA母链的一段碱基序列互补配对的一小段单链DNA或RNA。
2．DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。
3．影响萃取的因素
(1)主要因素：萃取剂的性质和使用量。
(2)次要因素：原料颗粒的大小、紧密程度、含水量、萃取的温度和时间等条件。
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幻灯片 164．萃取过程注意事项
(1)由于有机溶剂都是易燃物，直接使用明火加热容易引起燃烧、爆炸，因此萃取过程中应避免使用明火加热，采用水浴加热。
(2)为防止加热时有机溶剂挥发，还要在加热瓶口安装回流冷凝装置。
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幻灯片 17----
幻灯片 18植物的组织培养技术
高考地位：5年12考
(2012全国课标卷、山东卷、江苏
卷，2011江苏卷，2010全国课标
卷、安徽卷、浙江卷……)
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幻灯片 19----
幻灯片 20二、影响植物组织培养的因素及成功的关键
1．影响因素
(1)内部因素：材料的选取。
(2)外部因素：营养成分的种类及配比；植物激素的用量及使用顺序；pH、温度、光照等。
2．获得成功的关键
(1)植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗逆性差，对培养条件要求较高。
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幻灯片 21(2)培养材料一旦被微生物污染，就会导致实验失败。原因是微生物增殖快，生长迅速，消耗养分多，并产生代谢废物毒害培养材料。
(3)无菌技术主要包括对操作空间、实验用具、实验材料以及操作者的消毒灭菌。
提醒 一旦发现培养物被污染，特别是真菌性污染，一定不要打开培养瓶。应先将被污染的培养瓶统一放在高压蒸汽灭菌锅内进行高压蒸汽灭菌，然后再打开培养瓶进行清理。
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幻灯片 22三、植物激素在组织培养过程中的重要作用
生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素，其作用及特点为：
1．在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势。
2．使用顺序不同，结果不同(具体如下表)
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幻灯片 23----
幻灯片 24★★ 本部分内容与必修内容细胞分化有密切关系，是高考命题的热点，命题多考查植物组织培养基成分与作用、微型繁殖技术、脱毒苗培养、名贵中药材工厂化生产等具体实例，复习中应多加关注。
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幻灯片 25【典例1】
(2012·课标，39)为了探究6-BA和IAA对某菊花品种茎尖外植体再生丛芽的影响，某研究小组在MS培养基中加入6-BA和IAA，配制成四种培养基(见下表)，灭菌后分别接种数量相同、生长状态一致、消毒后的茎尖外植体，在适宜条件下培养一段时间后，统计再生丛芽外植体的比率(m)，以及再生丛芽外植体上的丛芽平均数(n)，结果如下表。
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幻灯片 26----
幻灯片 27回答下列问题。
(1)按照植物的需求量，培养基中无机盐的元素可分为__________和__________两类。上述培养基中，6-BA属于________类生长调节剂。
(2)在该实验中，自变量是________，因变量是________，自变量的取值范围是________。
(3)从实验结果可知，诱导丛芽总数最少的培养基是________号培养基。
(4)为了诱导该菊花试管苗生根，培养基中一般不加入________(填“6-BA”或“IAA”)。
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幻灯片 28解析 本题考查植物组织培养的相关知识。(1)植物组织培养常用MS培养基，其中，无机盐的元素可分为大量元素和微量元素两类，前者如N、P、K、Ca、Mg、S等，后者如B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo等。MS培养基中还常需要添加能诱导细胞分裂、脱分化、再分化的生长素和细胞分裂素，常用的生长素有2,4D、IAA、NAA等，常用的细胞分裂素有6-BA、KT等。(2)该实验中，各组6-BA浓度均为0.5 mg/L，IAA的浓度不相同，故自变量为IAA浓度，IAA浓度范围为0～0.5 mg/L。据表可知，该实验因变量是再生丛芽外植体的比率(m)以及再生丛芽外植体上的丛芽平均数(n)。(3)由表格中的数据可知，1号培养基诱导丛芽总数最少。(4)生长素常用于诱导细胞分裂和根的分化，6BA一般用于诱导植物的愈伤组织分化出丛芽，故诱导菊花试管苗生根，培养基中一般不加入6-BA。
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幻灯片 29答案 (1)大量元素 微量元素 细胞分裂素
(3)IAA浓度 再生丛芽外植体的比率(m)和再生丛芽外植体上的丛芽平均数(n) 0～0.5 mg/L
(3)1 (4)6-BA
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幻灯片 30多聚酶链式反应扩增DNA片段
高考地位：5年7考
(2012江苏卷，2011江苏卷、安
徽卷，2010广东卷……)
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幻灯片 311．细胞内DNA复制与体外DNA扩增(PCR技术)的比较
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幻灯片 32----
幻灯片 332.PCR反应的过程及结果
(1)PCR反应过程
①变性：当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链，(如下图)。
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幻灯片 34②复性：系统温度下降至50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，(如下图)。
③延伸：当系统温度上升至72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，(如下图)。
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幻灯片 35(2)结果
①PCR一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、复性、延伸三步。
②两引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。
提醒 DNA复制需要引物的原因：DNA聚合酶不能从5′端开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。
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幻灯片 36本知识点高考未曾单独考，往往与基因工程等内容综合起来考查，复习中不容忽视。
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幻灯片 37【典例2】
(2013·潍坊模考)多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。请回答下列问题。
(1)DNA的两条链是反向平行的，通常将________的末端称为5′端，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的________开始延伸DNA链。
(2)PCR利用了DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。到20世纪80年代，科学家从一种Taq细菌中分离到________，它的发现和应用解决了上述问题。要将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫________。
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幻灯片 38(3)PCR的每次循环可以分为________三步。假设在PCR反应中，只有一个DNA片段作为模板，请计算在5次循环后，反应物中大约有________个这样的DNA片段。
(4)简述PCR技术的主要应用：_____________(要求至少答两项)。
答案 (1)磷酸基团 3′端 (2)耐高温的Taq DNA聚合酶 选择培养基 (3)变性、复性和延伸 32 (4)遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等
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幻灯片 391．常用的蛋白质分离方法
(1)凝胶色谱法
①识图
蛋白质的提取和分离(以血红蛋白的提取和分离为例)
高考地位：5年1考
(2011广东理综)
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幻灯片 40凝胶色谱法分离蛋白质的原理
②分析比较列表如下：
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幻灯片 41(2)电泳法原理
①在一定pH下，一些生物大分子(如多肽、核酸等)可解离的基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
②由于分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种分子的分离。
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幻灯片 422．血红蛋白的提取和分离
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幻灯片 433．结果分析与评价
(1)血红蛋白的提取和分离时红细胞分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。
(2)凝胶的装填标准是紧密、均匀。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。
(3)G-75：“G”代表凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5 g。
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幻灯片 44(4)装填完后，立即用洗脱液洗脱的目的是使凝胶装填紧密。
(5)实验过程中加入柠檬酸钠的目的是防止血液凝固；低速、短时离心防止白细胞沉淀；缓慢搅拌防止红细胞破裂释放出血红蛋白。
(6)检测血红蛋白的分离是否成功的方法：如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。
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幻灯片 45本考点高考命题较少涉及，为冷考点，复习时还应熟悉血红蛋白提取和分离的程序和原理。
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幻灯片 46【典例3】
血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2和部分CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。
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幻灯片 47(1)将实验流程图补充完整：A为________，B为________。凝胶色谱法的基本原理是根据________分离蛋白质的有效方法。
(2)洗涤红细胞的目的是去除________，洗涤次数过少，无法除去________；离心速率过快和时间过长会使________一同沉淀，达不到分离的效果。洗涤干净的标志是________。释放血红蛋白的过程中起作用的是_________________。
(3)在洗脱过程中加入物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)的目的是____________________。
如果红色区带__________________，说明色谱柱制作成功。
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幻灯片 48答案 (1)血红蛋白的释放 样品的加入和洗脱 相对分子质量的大小 (2)杂蛋白(血浆蛋白) 血浆蛋白 白细胞和淋巴细胞 离心后的上清液中没有黄色 蒸馏水和甲苯 (3)准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pH和体内的一致 均匀一致的移动
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幻灯片 491.(2012·山东理综，34)辣椒素作为一种生物碱广泛用于食品保健、医药工业等领域。辣椒素的获得途径如下图。
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幻灯片 50(1)图中①和②分别表示辣椒组织培养中细胞的________和________过程。
(2)图中培养外植体的培养基中常用的凝固剂是______。培养基中的生长素和细胞分裂素用量的比值________(填“高”或“低”)时，有利于芽的分化。对培养基彻底灭菌时，应采取的灭菌方法是________。
(3)图中外植体的消毒所需酒精的体积分数是________。用酶解法将愈伤组织分离成单细胞时，常用的酶是______和纤维素酶。
(4)提取辣椒素过程中，萃取加热时需安装冷凝回流装置，其目的是________。
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幻灯片 51解析 此题借助辣椒素的提取与分离考查植物组织培养知识。(1)由外植体培养成脱毒苗的过程为植物组织培养过程，需经过脱分化、再分化两个阶段。(2)植物组织的培养常用固体培养基，固体培养基常用的凝固剂是琼脂。植物组织培养时，常用生长素和细胞分裂素启动细胞分裂、脱分化和再分化，当细胞分裂素较多时，利于芽的分化；当生长素较多时，利于根的分化。培养基的彻底灭菌常用高压蒸汽灭菌法。(3)体积分数为70%的酒精杀菌效果最强，操作者和外植体的消毒常用体积分数为70%的酒精。将愈伤组织分离成单个细胞常用纤维素酶和果胶酶。(4)辣椒素的提取常用有机溶剂，为防止有机溶剂的挥发，提取辣椒素过程中，在萃取加热时需安装冷凝回流装置。
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幻灯片 52答案 (1)脱分化(或去分化) 再分化 (2)琼脂 低 高压蒸汽灭菌 (3)70% 果胶酶 (4)防止有机溶剂的挥发
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幻灯片 532．(2012·江苏单科，31)某研究组对籼稻开展了组织培养及相关研究，请回答下列问题。
(1)2,4-D常用于籼稻愈伤组织的诱导，对形态的发生有一定的抑制作用。为促进愈伤组织再分化，在配制分化培养基时需________(填“升高”、“保持”或“降低”)2,4-D的浓度。
(2)当籼稻愈伤组织在只含有细胞分裂素的培养基上培养时，出现具有分生能力的绿色芽点，但不能继续出芽，通常在培养基中添加________________________，以促进幼苗形成。
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幻灯片 54(3)研究中用显微镜可以观察到的现象是________(填下列序号)。
①绿色芽点细胞排列松散 ②刚融合的籼稻和稗草杂交细胞发生质壁分离 ③胚状体细胞中有叶绿体 ④分化的愈伤组织内各细胞的形态大小一致
(4)经组织培养筛选获得的籼稻叶绿素突变体，其叶绿素a与叶绿素b的比值显著大于对照，叶绿素总量不变。某同学用________(填序号：①绿色②红色③蓝紫色④黄色)光照射突变体和对照叶片，检测到两者光合放氧速率差异不大。若取等量色素提取液进行层析，会发现突变体第________条色素带(自上而下)窄于对照组。
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幻灯片 55(5)胚乳(3n)由一个精子与两个极核受精发育而成。若用籼稻种子的胚乳诱导愈伤组织，培育三倍体，需适时剔除胚，以免胚的存在影响愈伤组织细胞的____，还可避免再生苗中混有____。
解析 本题主要考查植物组织培养的相关知识。(1)因2,4-D能抑制形态的发生，所以在促进愈伤组织再分化时，分化培养基中应降低2,4-D的浓度。(2)添加适量的生长素利于愈伤组织再分化出芽，促进幼苗的形成。(3)有分生能力的绿色芽点细胞排列紧密；刚融合的籼稻和稗草杂交细胞还没有再生细胞壁，不能发生质壁分离；愈伤组织由无定形状态的薄壁细胞构成，其内的细胞形态大小不一致；因胚状体细胞中有具有分生能力的绿色芽点，用显微镜可观察到胚状体细胞中有叶绿体。
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幻灯片 56(4)因籼稻叶绿素突变体中叶绿素a与叶绿素b的比值增大而叶绿素总量不变，所以突变体中叶绿素a增加，叶绿素b减少，则自上而下第4条色素带变窄；因叶绿素a、b主要吸收红光和蓝紫光，对绿光和黄光吸收较少，所以用绿光和黄光照射突变体和对照叶片，检测到两者放氧速率差别不大。(5)胚由二倍体细胞组成，在培育三倍体时，需要剔除种子中的胚，以免胚的存在影响愈伤组织细胞的增殖与分化，还可避免出现二倍体幼苗。
答案 (1)降低 (2)适量的生长素 (3)③ (4)①④ 4
(5)增殖与分化 二倍体幼苗
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幻灯片 573．(2011·广东理综，5)以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是
( )。
A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂
B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少
C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测
D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢
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幻灯片 58解析 猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少，是提纯血红蛋白的理想材料。提纯血红蛋白分四步：红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液、透析，其中洗涤红细胞时，要用生理盐水反复洗涤，既要将红细胞洗涤干净，又要不破坏红细胞，然后再用蒸馏水和甲苯使红细胞破裂，释放出血红蛋白。分离提纯血红蛋白时用凝胶色谱法，是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质，相对分子质量大的蛋白质移动速度较快；血红蛋白的颜色可用于观察红色区带的移动情况，并据此判断分离效果。故D不正确。
答案 D
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幻灯片 59见Word版活页训练
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